LOC101929897活化NF-κB途徑促進肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制.pdf

1、在全球范圍內(nèi)，肺腺癌的發(fā)病率、死亡率均位于癌癥之首，隨著精準醫(yī)療時代的來臨，肺腺癌的研究重點轉(zhuǎn)向基于腫瘤分子特性的靶向治療，因此闡明肺腺癌復雜的分子機制已成為肺腺癌研究的主流趨勢，而關鍵基因和關鍵信號途徑異常是肺腺癌分子機制的主要研究對象。且肺腺癌組織細胞多在早期即伴有NF-κB信號途徑的激活[1，2]，并與肺腺癌TNM分期和較差的預后密切相關[2，3]。盡管對于NF-κB信號途徑激活的詳細分子機制尚未完全了解，但通過各種途徑抑制NF-

2、κB可抑制肺腺癌細胞的生長增殖，已被大量實驗證據(jù)證明[4，5]。因此干預NF-κB信號途徑已成為肺腺癌靶向治療的策略之一。
　　lncRNA(long non-coding RNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200nt的RNA，主要由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，多具有5'帽和多聚腺苷酸尾，無蛋白質(zhì)編碼功能或僅編碼微肽。因具有相對較長的核苷酸鏈，lncRNA可在分子內(nèi)折疊形成許多特定復雜的二級空間結構，能提供多個與分子結合的位點，共同發(fā)揮生物學功

3、能，同時也造成了lncRNA復雜多樣的調(diào)節(jié)功能機制[6]。目前僅有少部分lncRNA的結構和功能得到了研究。
　　近年來，關于lncRNA參與NF-κB信號途徑調(diào)控的研究已陸續(xù)開展。2015年，Krawczyk等鑒定了一個新的lncRNA PACER。通過直接作用，PACER促進抑制型的p50/p50二聚體被激活型的p65/p50二聚體取代，結合結構基因COX2的啟動子，從而激活該基因轉(zhuǎn)錄[7]。因此lncRNA不僅參與NF-κB

4、信號途徑的調(diào)控，其本身更應看作NF-κB信號網(wǎng)絡的組成成分，目前這方面的研究剛剛開始，更多l(xiāng)ncRNA和NF-κB信號途徑的關聯(lián)性有待發(fā)掘。同時，病理情況下，lncRNA本身的表達或功能異?？赡芤餘F-κB信號途徑的功能異常，因此對NF-κB信號途徑相關lncRNA的篩選鑒定，可能拓展對NF-κB異常激活的分子機制的認識，且為肺腺癌患者的個體化治療提供更多可能的候選靶點。而在肺腺癌中，lncRNA LOC101929897對NF-κB

5、經(jīng)典途徑的作用還未有人研究。
　　第一部分LOC101929897通過上調(diào)IKKβ活化經(jīng)典NF-κB途徑，促進肺腺癌發(fā)生發(fā)展的機制研究
　　研究目的:明確lncRNA LOC101929897是否通過上調(diào)并激活IKKβ，進而激活經(jīng)典的NF-κB信號途徑，從而促進肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。
　　1、芯片檢測
　　利用芯片檢測三對肺腺癌和癌旁正常組織標本中l(wèi)ncRNA和mRNA表達譜的改變，分析芯片結果，篩選其中差異表達的l

6、ncRNAs，芯片結果顯示:相比癌旁正常組織，在肺腺癌組織中有585個lncRNA表達上調(diào)，有2294個lncRNA表達下調(diào)，且有835個mRNA表達上調(diào)，有845個mRNA表達下調(diào)，其中，lncRNA LOC101929897和IKKβ表達同步上調(diào)。
　　2、標本驗證
　　提取上述三對肺腺癌和癌旁正常組織標本的總RNA和總蛋白，應用qRT-PCR、Western blotting驗證LOC101929897、IKKβ mR

7、NA的表達水平是否與芯片結果一致，結果顯示:肺腺癌組織相較于癌旁正常組織，均呈現(xiàn)LOC101929897和IKKβ的表達同步上調(diào)。
　　3、LOC101929897、IKKβ在肺腺癌細胞中的基礎表達以及NF-κB基礎活性檢測。01)用qRT-PCR、Northern blotting檢測比較多個肺腺癌細胞株與肺正常上皮細胞株的LOC101929897、IKKβ mRNA表達水平，Western blotting檢測比較IKKβ的表

8、達水平，結果顯示:肺腺癌細胞株相對于肺正常上皮細胞株均呈現(xiàn)IKKβ和LOC101929897的同步上調(diào)，且上調(diào)程度與肺腺癌細胞的惡性程度呈正相關。
　　2)應用報告基因分析和凝膠滯留法(EMSA)檢測比較多個肺腺癌細胞株和肺正常上皮細胞株的NF-κB基礎活性，結果顯示:NF-κB的活性增強與LOC101929897、IKKβ上調(diào)趨勢一致，且與肺腺癌細胞的惡性程度呈正相關。
　　4、LOC101929897通過上調(diào)IKKβ激活

9、經(jīng)典的NF-κB信號途徑
　　根據(jù)3的結果，構建LOC101929897及其反義鏈表達載體，設計合成LOC101929897S的siRNA。選取LOC101929897相對低表達的A549細胞和相對高表達的HCC827細胞，在前者過表達LOC101929897，在后者干擾LOC101929897表達，進行功能獲得和功能缺失分析，qRT-PCR檢測LOC101929897和IKKβ mRNA的表達改變; Western blotti

10、ng檢測總IKKβ、P-IKKβ、總IκBα、P-IκBα的含量變化;EMSA檢測NF-κB的核內(nèi)遷移，結果顯示:與表達LOC101929897反義鏈的陰性參照相比，過表達LOC101929897的A549細胞，其總IKKβ、pIKKβ升高，總IκBα降低，pIκ Bα升高，NF-κB核內(nèi)遷移增多;反之，在HCC827細胞敲低LOC101929897的表達，上述結果與過表達LOC101929897相反。
　　5、LOC101929

11、897促進肺腺癌細胞增殖、遷移，抑制凋亡的作用研究在LOC101929897過表達和干擾的肺腺癌細胞中，采用MTT、平板克隆形成實驗、流式細胞技術、Transwell和劃痕實驗等檢測LOC101929897對肺腺癌細胞增殖能力、克隆形成能力、遷移能力的影響，結果顯示:與表達LOC101929897反義鏈的陰性參照相比，過表達LOC101929897的A549細胞，增殖、遷移能力增強，細胞周期無明顯變化;反之，在HCC827細胞敲低LOC

12、101929897的表達，細胞增殖、遷移能力減弱，細胞周期無明顯變化。
　　結論:LOC101929897通過上調(diào)IKKβ活化經(jīng)典NF-κB途徑，從而促進肺腺癌發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分初步確定LOC101929897在肺腺癌中上調(diào)IKKβ的分子機制
　　研究目的:初步確定LOC101929897是否作為ceRNA，通過與IKKβ mRNA競爭結合miR-4741，增強IKKβ mRNA的穩(wěn)定性，從而上調(diào)IKKβ。

13、>　　研究方法和結果:
　　1、確定LOC101929897對IKKβ的上調(diào)作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平
　　1)亞細胞定位:分別提取肺腺癌細胞A549、H1299和HCC827的細胞核和細胞漿RNA，利用qRT-PCR進行絕對定量，測定LOC101929897在核漿分布比例;利用RNA熒光原位雜交，制備A549、H1299和HCC827細胞涂片，用激光共聚焦顯微鏡檢測LOC101929897的亞細胞定位，結果顯示: LOC1019

14、29897大部分位于細胞漿中，少部分位于細胞核中。
　　2)生物信息學分析:應用RegRNA2.0、TargetScan7.1分析LOC101929897序列，發(fā)現(xiàn)無ORF，包含miR-512-5p和miR-4741應答元件，同時miR-4741也靶向IKKβ mRNA。
　　3)用Act-D處理A549、H1299、HCC827細胞，提取總RNA，qRT-PCR測定IKKβ mRNA的半衰期，結果顯示:在三種細胞中，A54

15、9的IKKβ mRNA半衰期時間為3.4h，H1299為8.2h，HCC827為13.7h。
　　4)在A549中過表達LOC10192989724h后，用Act-D處理細胞，提取總RNA，測定IKKβ mRNA的半衰期，結果顯示:對照組A549中IKKβ mRNA的半衰期時間為3.3h，過表達LOC101929897后，IKKβ mRNA的半衰期為8.7h。
　　5)構建pGL4.10[luc2]-pIKB KB重組質(zhì)粒，

16、在A549和HCC827中分別以pcDNA3.1(+)，非特異性干擾RNA(nc)分別作為陰性參照，在A549中過表達LOC10192989724h，HCC827中干擾LOC101929897表達24h后，再瞬時轉(zhuǎn)染pGL4.10[luc2]-p IKB KB，pRL-TK作為內(nèi)參，測定雙熒光素酶活性，結果顯示:和陰性對照相比，過表達或者干擾LOC101929897后，兩種細胞中pGL4.10[luc2]-pIKBKB的活性無明顯變化。

17、
　　2、初步判斷LOC101929897是一個ceRNA
　　1)提取A549、H1299、HCC827細胞的總RNA，用qRT-PCR檢測miR-4741和miR-512-5p的相對含量，結果顯示:在三種細胞中miR-4741無明顯變化;miR-512-5p在A549中含量最高，在HCC827中最低。
　　2)用Act-D處理A549、H1299、HCC827細胞，提取總RNA，測定LOC101929897的半衰期

18、，結果顯示:A549的LOC101929897半衰期為6.6h，H1299為9.3h，HCC827為13.7h。
　　3、LOC101929897作為ceRNA的分子機制研究
　　用miR-512-5p inhibitor瞬時轉(zhuǎn)染HCC827，用miR-512-5p mimics瞬時轉(zhuǎn)染H1299，提取總RNA和總蛋白，用qRT-PCR檢測IKKβ和LOC101929897，Western檢測IKKβ蛋白水平，結果顯示:在H