微粒(MPs)定量檢測方法、條件的建立及其免疫學(xué)功能的實驗研究.pdf

1、目的：微粒（MPs）作為細胞釋放的一種“亞細胞結(jié)構(gòu)”已經(jīng)在自身免疫等多種疾病中被發(fā)現(xiàn)。已有研究表明MPs可打破免疫耐受，觸發(fā)自身免疫應(yīng)答。本研究旨在通過對MPs分析前影響因素的研究，建立一種MPs定量檢測的優(yōu)化平臺，同時針對血漿和細胞培養(yǎng)上清液中MPs的研究，探討其免疫刺激作用的發(fā)揮。
　　方法：
　　1．MPs定量檢測方法及影響因素的分析
　　（1）選取蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院SLE、RA及年齡和性別相匹配健康對照者

2、（HC）各20例；
　?。?）采用流式細胞術(shù)（FCM）和Bradford蛋白定量兩種方法分別檢測20例SLE患者血漿中總MPs的含量，并對比分析這兩種檢測方法的相關(guān)性；
　?。?）流式細胞儀計數(shù)不同抗凝劑[枸櫞酸鹽，乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2），肝素]和無抗凝劑血漿中總MPs的含量；
　　（4）流式細胞儀計數(shù)不同標本洗滌方式[洗滌貧血小板血漿（洗滌PPP）和直接貧血小板血漿（直接PPP）]下血漿中總MPs的含量；

3、
　　（5）流式細胞儀計數(shù)不同保存溫度（4，-20，-80℃）和時間（1，3，7，10，14d）條件下血漿中總MPs的含量。
　　2． MPs體外免疫學(xué)功能的檢測
　　（1）血漿中MPs的免疫學(xué)功能
　　a．選取蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院及門診SLE患者28例、RA患者29例及年齡和性別相匹配HC40例；
　　b．流式細胞術(shù)分別檢測SLE、RA及HC血漿中總MPs、LDMPs和MDMPs的含量；
　　c

4、.選取SLE、RA及HC患者各三例，將新鮮EDTA-K2抗凝血漿經(jīng)過離心洗滌制成含有MPs的洗滌貧血小板血漿（洗滌PPP），然后體外與PBMC共孵育48h，CBA檢測細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子的分泌情況。
　　（2）細胞培養(yǎng)上清液中MPs的免疫學(xué)功能
　　a．采用LPS、CAM及STS刺激THP-1細胞活化或凋亡；采用PMA+PHA、CAM及STS刺激Jurkat細胞活化或凋亡，同時流式細胞儀計數(shù)這兩種細胞株刺激前及刺激后細胞

5、培養(yǎng)上清液中MPs的釋放情況；
　　b．將凋亡THP-1細胞來源的單核細胞微粒（MDMPs）按照低、中和高濃度（10，20和40μg/mL）分別與Jurkat和PBMC細胞體外共培養(yǎng)14h，流式細胞儀檢測T細胞表面中晚期活化分子CD71的表達情況；
　　c.將凋亡THP-1細胞來源的單核細胞微粒（MDMPs）按照低、中和高濃度（10，20和40μg/mL）分別與Jurkat和PBMC細胞體外共培養(yǎng)48h，CBA檢測細胞培養(yǎng)上

6、清液中細胞因子的分泌情況。
　　結(jié)果：
　　1． MPs定量檢測方法及影響因素的分析
　　（1）流式細胞術(shù)法和Bradford蛋白定量法檢測血漿中總MPs含量之間存在較高的相關(guān)性（r=0.597，P<0.01）；
　?。?）枸櫞酸鹽抗凝血漿中總MPs含量最多（F=25.04，P<0.01），與EDTA-K2、肝素及無抗凝劑血漿中總MPs含量相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；
　?。?）SLE、RA

7、和HC三組血漿直接PPP中總MPs含量均高于洗滌PPP中總MPs含量（均P<0.05）；
　　（4）與相同保存溫度下保存0d即新鮮血漿中總MPs含量比較，4℃，-20℃和-80℃三個溫度下分別保存1，3，7，10d血漿中總MPs含量逐漸下降（均P<0.05）；而三個溫度下分別保存14d血漿中總MPs含量逐漸升高，與相同保存溫度保存0d的新鮮血漿中總MPs含量比較無明顯差異。分別對三個溫度下相同保存時間血漿中總MPs含量兩兩比較結(jié)果

8、顯示，新鮮血漿標本于4℃，-20℃和-80℃條件下分別放置1，3，7，10和14d血漿中總MPs含量無明顯差異（均P<0.05）。
　　2． MPs體外免疫學(xué)功能的檢測
　?。?）血漿中MPs的免疫學(xué)功能
　　a．SLE、RA患者血漿中總MPs、LDMPs及MDMPs含量均高于HC（均P<0.05）；
　　b．與健康對照者（HC）相比，SLE患者血漿中MPs能刺激PBMC分泌IL-6、TNF、IFN-γ（均P<0

9、.05），RA患者血漿中MPs能促進PBMC分泌IL-6（P<0.05）。
　?。?）細胞培養(yǎng)上清液中MPs的免疫學(xué)功能
　　a. THP-1細胞組：與未加刺激的對照組相比，CAM和STS均能刺激THP-1細胞釋放單核細胞微粒（MDMPs）（均P<0.05），而LPS能誘導(dǎo)THP-1細胞釋放MDMPs，但無明顯差異（P>0.05）；Jurkat細胞組：與未加刺激劑的對照組相比，STS、CAM和PMA+PHA均能刺激Jurka

10、t細胞釋放淋巴細胞微粒（LDMPs）且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；
　　b.與陰性對照組相比，20μg/mL和40μg/mL MDMPs均能誘導(dǎo)Jurkat細胞表面CD71分子表達水平增加（均P<0.05），且隨MDMPs濃度的增加而表達水平增高；（10，20和40μg/mL） MDMPs均能刺激PBMC細胞表面CD71分子表達水平增加（均P<0.05），且隨MDMPs濃度的增加而表達率升高；
　　c.與陰性對照組相

11、比，（10，20和40μg/mL）MDMPs均能刺激PBMC IL-10的分泌（均P<0.05），同時40μg/mL MDMPs還能促進PBMC IFN-γ的分泌（P<0.01），此外，不同濃度MDMPs還能誘導(dǎo)PBMC大量分泌IL-6，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；20μg/mL和40μg/mL MDMPs能誘導(dǎo)Jurkat細胞IL-6的分泌（均P<0.05），而10μg/mL MDMPs無此現(xiàn)象。
　　結(jié)論：（1）血漿中MP