羅勒多糖及姜黃素差異性影響人卵巢癌SKOV3細(xì)胞及DCs遷移的研究.pdf

1、研究目的：
　　分析研究羅勒多糖及姜黃素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移活性的影響及機(jī)制，同時(shí)觀察兩種藥物對(duì)人外周血來源樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)分化及遷移能力的影響。以期為篩選差異調(diào)控腫瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞遷移活性的制劑提供數(shù)據(jù)依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.人外周血來源DCs的培養(yǎng)
　　免疫磁珠法分離人外周血CD14+單核細(xì)胞，置于RPMI1640培養(yǎng)液中，與1000U/ml GM-CSF、5

2、00U/ml IL-4聯(lián)合培養(yǎng)5天后形成未成熟DCs(imDCs)，第5天時(shí)加入1μg/ml LPS誘導(dǎo)促使DC成熟分化為成熟DCs(mDCs)，培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分別測(cè)定mDCs及imDCs細(xì)胞表面標(biāo)志物以明確其表型。
　　2.羅勒多糖及姜黃素對(duì)人外周血來源DCs成熟的影響
　　將羅勒多糖和姜黃素、LPS分別加入imDCs中，分為imDCs組、imDCs+姜黃素組、imDCs+LPS組、imDCs+LP

3、S+姜黃素組、imDCs+羅勒多糖組、imDCs+LPS+羅勒多糖組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物及吞噬功能，ELISA法檢測(cè)DCsIL-12分泌水平，探討羅勒多糖和姜黃素對(duì)DCs發(fā)育影響的差異性。
　　3.羅勒多糖和姜黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和人外周血來源DCs遷移活性的影響
　　Transwell試驗(yàn)分析羅勒多糖和姜黃素對(duì)SKOV3細(xì)胞和人外周血來源DCs遷移能力的影響;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定羅勒多糖和姜黃素處理后SK

4、OV3細(xì)胞和人外周血來源DCs中MMP-9及OPN含量;Western-blot法和實(shí)時(shí)定量PCR分析羅勒多糖和姜黃素處理后SKOV3細(xì)胞和人外周血來源DCs中OPN蛋白及mRNA表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)羅勒多糖和姜黃素處理后SKOV3細(xì)胞和人外周血來源DCs中CD44表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　1.人外周血單核細(xì)胞中CD14+細(xì)胞經(jīng)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)后獲得imDCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs表型結(jié)果顯示，經(jīng)GM-CSF

5、和IL-4誘導(dǎo)獲得的imDCs可見CD1a、CD209陽性表達(dá)，CD80、CD86及HLA-DR低表達(dá)，CD14和CD83不表達(dá);LPS刺激后獲得DCs可見CD1a、CD209、CD83、CD86及HLA-DR陽性表達(dá)，提示DCs已發(fā)育至成熟狀態(tài)。
　　2.imDCs培養(yǎng)至第5天時(shí)，分別加入100μg/ml的羅勒多糖(BPS)或50μM姜黃素(Cur)與LPS(1μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，imDCs+Cur組和imDC+LPS

6、+Cur組中CD80、CD83、CD86、HLA-DR陽性率與imDC組相比未發(fā)生明顯變化;與單純LPS刺激組相比，imDCs+LPS+Cur組中CD80、CD83、CD86、HLA-DR陽性比例明顯降低(p＜0.05)，其值分別為（36.9±2.7）％，（5.0±0.4）％、（29.1±1.8）％和（35.6±1.7）％，提示Cur可拮抗LPS促DCs成熟作用;LPS和BPS單獨(dú)處理組可見DCs表面CD80、CD83、CD86、HLA

7、-DR表達(dá)陽性率升高(p＜0.05)，且二者的作用效果相當(dāng)，提示BPS可促DCs表面標(biāo)志物的表達(dá)。
　　2.imDC分別加入LPS、100μg/ml的羅勒多糖(BPS)或50μM姜黃素(Cur)處理后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs吞噬FITC-葡聚糖能力。與imDCs組相比，LPS刺激后mDCs的吞噬能力明顯降低(p＜0.05)，僅為（12.5±2.1）％;單獨(dú)給予Cur干預(yù)后DCs的FITC-葡聚糖攝取能力未發(fā)生明顯變化;與LPS單獨(dú)刺

8、激組相比，imDCs+LPS+Cur組攝取葡萄糖陽性細(xì)胞比為（24.8±3.7）％，明顯高于imDCs+LPS組(p＜0.05)，提示姜黃素可抑制LPS促DCs成熟作用;imDCs給予BPS干預(yù)后，流式細(xì)胞儀測(cè)定DCs攝取葡萄糖陽性細(xì)胞率為（20.2±2.8）％，與imDCs組相比其吞噬能力顯著降低(p＜0.05)，其效果與單獨(dú)LPS刺激組相當(dāng)，提示BPS具有與LPS相似的促DCs成熟作用。
　　3.ELISA法測(cè)定羅勒多糖(BP

9、S)或姜黃素(Cur)處理后DCs培養(yǎng)液上清中IL-12水平，imDCs組培養(yǎng)液上清中IL-12含量為72.47±4.51 pg/ml，經(jīng)LPS刺激后其含量增加至197.63±13.22 pg/ml(p＜0.05)，提示LPS可增強(qiáng)DCs IL-12的分泌能力;單獨(dú)給予Cur干預(yù)后DCs IL-12分泌水平與imDCs組相比無明顯變化;與LPS單獨(dú)刺激組相比，imDCs+LPS+Cur組DCs培養(yǎng)上清中IL-12含量顯著降低(p＜0.0

10、5)，其值為95.47±8.99 pg/ml; imDCs給予BPS干預(yù)后，DCs IL-12分泌水平可達(dá)143.51±9.92 pg/ml，明顯高于imDCs組，表明BPS可增強(qiáng)DCs IL-12分泌能力。
　　4.卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和DCs分別經(jīng)100μg/ml的羅勒多糖(BPS)或50μM姜黃素(Cur)處理，Transwell試驗(yàn)結(jié)果表明姜黃素及羅勒多糖均可顯著抑制SKOV3細(xì)胞的體外遷移活性(p＜0.05)，二者抑制

11、效率無明顯差別;與對(duì)照組相比，50μM姜黃素處理組imDCs和mDCs遷移的細(xì)胞數(shù)目明顯降低(p＜0.05)，100μg/ml羅勒多糖處理內(nèi)imDCs和mDCs遷移細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比無明顯變化。
　　5.卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和DCs分別經(jīng)100μg/ml的羅勒多糖(BPS)或50μM姜黃素(Cur)處理，ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-9含量，Cur組和BPS處理組SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-9的含量分別為17.

12、46±2.56 pg/ml和14.89±1.23 pg/ml，與對(duì)照組相比，羅勒多糖和姜黃素處理組SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-9含量顯著降低(p＜0.05);imDCs及mDCs經(jīng)BPS或Cur處理后，BPS處理組imDCs及mDCs培養(yǎng)上清中MMP-9的含量分別為22.63±5.72pg/ml和32.94±7.89 pg/ml，與對(duì)照組相比無明顯差異。Cur處理組中imDCs及mDCs MMP-9的分泌分別為10.03±1.64

13、 pg/ml和12.15±1.91 pg/ml，與對(duì)照組相比顯著降低(P＜0.05)，提示Cur可影響imDCs及mDCs MMP-9的分泌能力。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析SKOV3細(xì)胞、imDCs及mDCs經(jīng)Cur和BPS處理后MMP-9 mRNA表達(dá)水平，Cur處理組SKOV3、imDCs及mDCs MMP-9 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，其變化趨勢(shì)與imDCs及mDCs培養(yǎng)上清中MMP-9含量變化相一致。與對(duì)照組相比，

14、BPS處理組imDC及mDC MMP-9 mRNA表達(dá)水平未發(fā)生明顯改變。
　　5.100μg/ml的羅勒多糖(BPS)或50μM姜黃素(Cur)處理與SKOV3細(xì)胞與DCs共培養(yǎng)24 h后，Cur和BPS處理組SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中OPN含量分別為432.98±32.97 pg/ml和614.90±51.22 pg/ml，與對(duì)照組相比，Cur和BPS處理組SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中OPN含量顯著降低(P＜0.05);BPS處

15、理組imDCs及mDCs培養(yǎng)上清中OPN含量分別為2397.65±170.92 pg/ml和2863.64±132.91 pg/ml，與對(duì)照組相比無顯著差異。與Cur共同培養(yǎng)后，imDCs及mDCs培養(yǎng)上清中OPN含量分別降至1123.61±89.64 pg/ml和1483.34±99.84 pg/ml(P＜0.05)，提示Cur可抑制imDCs及mDCs OPN的分泌。Western-blot分析分析SKOV3細(xì)胞、imDCs及mDC

16、s經(jīng)Cur和BPS處理后OPN蛋白表達(dá)情況，Cur處理組SKOV3、imDCs及mDCs OPN蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，其變化趨勢(shì)與imDCs及mDCs培養(yǎng)上清中OPN含量變化相一致。與對(duì)照組相比，BPS處理組imDC及mDC OPN蛋白表達(dá)水平未發(fā)生明顯改變。
　　7.流式細(xì)胞儀分析SKOV3、imDCs及mDCs經(jīng)羅勒多糖(BPS)和姜黃素(Cur)處理后細(xì)胞表面CD44表達(dá)，Cur處理組SKOV3、imDCs及

17、mDCs表面CD44表達(dá)明顯低于BPS處理組。
　　結(jié)論：
　　1.羅勒多糖和姜黃素均可顯著抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移，并通過相似的機(jī)制OPN/MMP-9或OPN/CD44/MMP-9途徑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的遷移活性。羅勒多糖不影響SKOV3細(xì)胞CD44的表達(dá)，推測(cè)其可能通過其他機(jī)制如OPN的其他受體發(fā)揮相應(yīng)的抑制遷移效應(yīng)。
　　2.羅勒多糖與姜黃素對(duì)人外周血來源DCs的分化成熟影響不同，羅勒多糖促進(jìn)DCs發(fā)育

18、與成熟，而姜黃素則抑制DCs的成熟。
　　3.羅勒多糖與姜黃素對(duì)人外周血來源DCs的遷移活性影響不同，羅勒多糖不影響DCs遷移，但姜黃素可顯著影響其體外遷移能力。
　　4.與姜黃素不同，羅勒多糖在抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3遷移能力的同時(shí)不影響DCs的遷移，并能促進(jìn)DCs的成熟。因此，羅勒多糖是更為理想的抗腫瘤轉(zhuǎn)移制劑的候選制劑。
　　創(chuàng)新性：
　　1.發(fā)現(xiàn)并闡述了羅勒多糖及姜黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3遷移活性的影

19、響及機(jī)制，羅勒多糖雖也可通過影響OPN及MMP9通路抑制SKOV3細(xì)胞的遷移，但與姜黃素可能利用不同的OPN配體。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)羅勒多糖與姜黃素對(duì)人外周血來源DCs分化成熟影響的差異性，體外實(shí)驗(yàn)證明，羅勒多糖在抑制腫瘤細(xì)胞的遷移活性的同時(shí)還能促進(jìn)DCs成熟。
　　3.首次發(fā)現(xiàn)羅勒多糖與姜黃素對(duì)人外周血來源DCs遷移活性影響的差異，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，羅勒多糖在抑制腫瘤細(xì)胞遷移活性的同時(shí)不影響DCs的遷移活性，提示羅勒多糖可能是