針灸對CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中黏附分子及造血因子的影響.pdf

1、目的:化療做為治療惡性腫瘤的主要手段之一，其最大的不良反應(yīng)之一就是導(dǎo)致骨髓造血及骨髓造血微環(huán)境損害，引起骨髓抑制、外周血白細(xì)胞降低，繼而機體導(dǎo)致出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)。骨髓造血微環(huán)境對造血實質(zhì)細(xì)胞的定居、增殖、分化、發(fā)育、成熟起著重要的調(diào)節(jié)作用。造血微環(huán)境主要由基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、造血生長因子組成。骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSC）是造血微環(huán)境的重要組成成分，通過產(chǎn)生分泌細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分而調(diào)節(jié)和發(fā)揮作用。本研究圍繞針灸對環(huán)

2、磷酰胺（CTX）化療后骨髓造血微環(huán)境的修復(fù)和調(diào)節(jié)作用，以骨髓造血微環(huán)境中粘附分子及造血因子為切入點，運用流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSC）細(xì)胞周期變化；運用光鏡觀察骨髓病理切片中紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系的形態(tài)學(xué)變化；并運用RT-qPCR和Western-Blot方法檢測骨髓造血微環(huán)境中粘附分子VCAM-1、ICAM-1和造血因子的SCF、TGF-β1的基因和蛋白表達(dá)量。以此來研究探討針灸對化療后骨髓造血微環(huán)境中粘附分子及造

3、血因子的調(diào)控作用以及對骨髓造血微環(huán)境的修復(fù)和保護(hù)作用。同時,為針灸改善化療后骨髓造血微環(huán)境損傷，提升白細(xì)胞，提供實驗依據(jù)。
　　方法:選用SPF級雄性昆明種（KM）小鼠120只,體重18±2g,在溫度為20℃-25℃、相對濕度為60％左右的清潔級實驗室中，自由喂養(yǎng)3天后，進(jìn)行造模。各小鼠依次稱重后，運用隨機分層分組的方法，將小鼠分為1d組、3d組、5d組，每組40只，再依次將1d組、3d組、5d組小鼠依次分為空白組、模型組、針刺組

4、、艾灸組每組10只。
　　具體造模方法依據(jù)由中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局編著的《新藥（西藥）臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》，采用環(huán)磷酰胺（CTX）腹腔注射建立小鼠骨髓抑制模型，按照100mg／kg／d劑量，連續(xù)應(yīng)用3天。依據(jù)環(huán)磷酰胺（CTX）藥物代謝動力學(xué)，用藥4小時后即失去藥物活性，即模型建立成功（具體造模依據(jù)：中山醫(yī)學(xué)院等編著.基礎(chǔ)藥理學(xué).人民衛(wèi)生出版社，1979:442）。
　　空白組依據(jù)0.02ml／g的用藥量，腹腔注射生理

5、鹽水。模型建立成功后4小時，進(jìn)行治療?？瞻捉M、模型組陪同固定，不做任何治療。針刺組先將小鼠固定于自制的鼠板上，選用特制的華佗牌美容毫針，具體規(guī)格為：0.19×10mm，針柄長20mm，依次針刺小鼠大椎、膈腧、腎俞、足三里，進(jìn)針3mm，留針6min，每日治療1次，其中1d組小鼠治療1次、3d組小鼠治療3次、5d組小鼠治療5次。艾灸組將小鼠固定于自制的鼠板上，選用特制的美容細(xì)艾條，艾條規(guī)格為：0.4×25cm，將艾條點燃后施灸小鼠大椎、膈俞

6、、腎俞、足三里，距離小鼠皮膚高度2cm，每穴3min，每天治療1次，其中1d組小鼠治療1次、3d組小鼠治療3次、5d組小鼠治療5次。
　　1d組、3d組、5d組治療結(jié)束后，觀察針灸對小鼠外周血白細(xì)胞的影響規(guī)律，并應(yīng)用光鏡觀察小鼠骨髓病理切片中骨髓紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系的形態(tài)學(xué)改變，再應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSC）細(xì)胞周期的變化，然后應(yīng)用RT-qPCR和Western-Blot方法檢測骨髓造血微環(huán)境中粘附

7、分子VCAM-1、ICAM-1和造血因子的SCF、TGF-β1的基因和蛋白表達(dá)量。通過觀察針灸后CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中粘附分子及造血因子的影響變化，從骨髓造血微環(huán)境方面探討針灸改善化療后修復(fù)和保護(hù)骨髓造血微環(huán)境，提升外周血白細(xì)胞的作用機制。實驗整個過程嚴(yán)格依據(jù)由國家科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。
　　結(jié)果:1.“實驗一”結(jié)果顯示：與空白組比較，1d組模型組、針刺、艾灸各組小鼠外周血白細(xì)胞逐漸下

8、降，與空白組比較，其余各組均降低，有顯著性差異（P<0.05）。3d組針刺組、艾灸組小鼠外周血白細(xì)胞均開始升高，針刺組療效優(yōu)于艾灸組，具有顯著性差異（P<0.05）。5d組針刺組、艾灸組小鼠外周血白細(xì)胞均升高，已達(dá)到正常值。
　　2.“實驗二”結(jié)果顯示:應(yīng)用光鏡觀察小鼠1d組、3d組、5d組骨髓瑞氏-吉姆薩染色病理切片，結(jié)果顯示：與模型組比較，針刺組和艾灸組紅細(xì)胞系數(shù)目增加，粒細(xì)胞系數(shù)目增加，有核細(xì)胞系數(shù)目增加，脂肪細(xì)胞減少，血竇

9、增加。隨著治療時間的延長，變化更為明顯。
　　3.“實驗三”結(jié)果顯示:應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測1d組、3d組、5d組小鼠骨髓造血微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞（BMSC）細(xì)胞周期G1期、S期、G2期細(xì)胞百分率變化，結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組中的3d組（P<0.05）與5d組（P<0.01）BMSC的G1期細(xì)胞百分率明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；針刺組中1d組（P<0.05）BMSC的G1期細(xì)胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；與空白組比較，模型

10、組中的1d組（P<0.05）與3d組、5d組（P<0.01）BMSC的S期細(xì)胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；與空白組比較，模型組中的1d組、3d組（P<0.05）與5d組（P<0.01） BMSC的G2期細(xì)胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，針刺組和艾灸組可以降低CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞G1期細(xì)胞含量，其中3d組、5d組均有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。與模型組比較，針刺和艾灸可以提高3d組BMSC的

11、S期細(xì)胞含量，針刺和艾灸可以降低5d組BMSC的S期細(xì)胞含量，均具有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05。與模型組比較，針刺和艾灸可以提高1d組、3d組、5d組BMSC的G2期細(xì)胞含量，均具有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05。與針刺組比較，艾灸組中的5d組（P<0.05） BMSC的G1期、S期細(xì)胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與針刺組比較，艾灸組3d組（P<0.05）BMSC的G2期細(xì)胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.“實驗四”

12、結(jié)果顯示:運用RT-qPCR法對1d組、3d組、5d組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中粘附分子VCAM-1、ICAM-1和造血因子SCF、TGF-β1的基因進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果顯示：在1d組實驗中，與空白組比較，模型組VCAM-1、SCF mRNA表達(dá)下調(diào)，具有顯著性差異，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，ICAM-1、TGF-β1mRNA表達(dá)升高，但無顯著性差異(P>0.05)，與模型組比較，針刺組、艾灸組均無統(tǒng)計學(xué)意義，但針刺、艾

13、灸后 VCAM-1、SCFmRNA表達(dá)均上調(diào)， ICAM-1、TGF-β1 mRNA表達(dá)均下調(diào)，但無顯著性差異(P>0.05)。
　　在3d組實驗中，與空白組比較，模型組VCAM-1、SCF mRNA表達(dá)下調(diào)，具有顯著性差異，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，ICAM-1、TGF-β1 mRNA表達(dá)升高，但無顯著性差異(P>0.05)。與模型組比較，針刺組和艾灸組VCAM-1、SCFmRNA表達(dá)均上調(diào)，針刺組具有顯著性差異，且有統(tǒng)計

14、學(xué)意義(P<0.05)，艾灸組無顯著性差異(P>0.05)；雖然針刺組和艾灸組ICAM-1、TGF-β1 mRNA表達(dá)均下調(diào)，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　在5d組實驗中，與空白組比較，模型組VCAM-1、SCF mRNA表達(dá)下調(diào)，具有顯著性差異，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，ICAM-1、TGF-β1 mRNA表達(dá)升高，具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，針刺組和艾灸組VCAM-1、SCFmRN

15、A表達(dá)均上調(diào)，無顯著性差異(P>0.05)；雖然針刺組和艾灸組ICAM-1、TGF-β1 mRNA表達(dá)均下調(diào)，針刺組具有顯著性差異，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，艾灸組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　5.“實驗五”結(jié)果顯示:運用Western-Blot法對1d組、3d組、5d組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中粘附分子VCAM-1、ICAM-1和造血因子SCF、TGF-β1的蛋白量進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果顯示：在1d組實驗中，

16、與空白組比較，模型組VCAM-1、SCF蛋白含量下降，且均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組表較，針刺組VCAM-1、SCF蛋白升高，且 VCAM-1蛋白具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);針刺組ICAM-1、TGF-β1蛋白含量下降，且TGF-β1蛋白具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);針灸1天后，與模型組比較，艾灸組VCAM-1、SCF蛋白升高，且VCAM-1蛋白具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

17、;艾灸組ICAM-1、TGF-β1蛋白含量下降，且都具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與針刺組比較，艾灸組VCAM-1、SCF蛋白升高、ICAM-1、TGF-β1蛋白含量下降，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　在3d組實驗中，與空白組比較，模型組VCAM-1、SCF蛋白含量下降，且VCAM-1具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；ICAM-1、TGF-β1蛋白含量升高，具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.0

18、5）；與模型組比較，針刺組VCAM-1、SCF蛋白含量升高，且有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；針刺組ICAM-1、TGF-β1蛋白含量減少，無顯著性差異。針灸治療3天后，與模型組比較，艾灸組VCAM-1、SCF蛋白含量升高，且VCAM-1蛋白具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；艾灸組ICAM-1、TGF-β1蛋白含量減少，具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與針刺組比較，艾灸組VCAM-1、SCF蛋白含

19、量升高、ICAM-1、TGF-β1蛋白含量減少，不具有顯著性差異，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　在5d組實驗中，與空白組比較，模型組VCAM-1、SCF蛋白含量下降，且具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；ICAM-1、TGF-β1蛋白含量升高，具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，針刺組VCAM-1、SCF蛋白含量升高，且SCF蛋白具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；針刺組ICAM-

20、1、TGF-β1蛋白含量減少，且TGF-β1蛋白具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。針灸治療5天后，與模型組比較，艾灸組VCAM-1、SCF蛋白含量升高，且具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；艾灸組ICAM-1、TGF-β1蛋白含量減少，具TGF-β1蛋白具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與針刺組比較，艾灸組VCAM-1、SCF蛋白含量升高，ICAM-1、TGF-β1蛋白含量減少。與針刺組比較，艾灸組VC

21、AM-1、SCF蛋白含量升高、ICAM-1、TGF-β1蛋白含量減少，不具有顯著性差異，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.針灸具有減輕環(huán)磷酰胺（CTX）化療小鼠骨髓抑制，提升外周血白細(xì)胞數(shù)量的作用，3d組開始回升，5d組達(dá)到正常值。
　　2.針刺和艾灸可以影響骨髓形態(tài)學(xué)改變，可以促進(jìn)紅細(xì)胞系、有核細(xì)胞系的細(xì)胞數(shù)量增加，可以減少粒細(xì)胞的數(shù)量。
　　3.烷化劑CTX破壞了骨髓基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期規(guī)律，

22、產(chǎn)生骨髓抑制，嚴(yán)重影響骨髓造血功能，針刺和艾灸可以促進(jìn)CTX化療后骨髓基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞修復(fù)，加速骨髓基質(zhì)細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，增強骨髓基質(zhì)細(xì)胞DNA的合成，延長G2期，同時利用細(xì)胞G2期阻滯的時機，盡快修復(fù)DNA，加速細(xì)胞有絲分裂，進(jìn)入增殖狀態(tài)，提高骨髓基質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)能力，保護(hù)骨髓造血微環(huán)境，促進(jìn)骨髓造血功能的重建。
　　4.針灸可以減輕環(huán)磷酰胺（CTX）化療引起的骨髓造血微環(huán)境損傷，其作用機制之一是：針灸能夠上調(diào)骨髓造血微環(huán)境