新生兒缺氧缺血腦損傷大鼠模型制備以及間充質(zhì)干細(xì)胞對模型損傷療效的研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)采用高原低壓環(huán)境模擬倉結(jié)合大鼠游泳運(yùn)動的方法制備高原地區(qū)新生兒缺氧缺血性腦病大鼠模型，觀察其行為學(xué)、腦組織病理變化、腦TTC染色和電鏡下紅細(xì)胞形態(tài)觀察，為HIE在高原地區(qū)的臨床研究做基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。
　　方法:將SD新生大鼠（10日齡）32只，隨機(jī)分為4組:對照組為A組，實(shí)驗(yàn)組:B組（2000m組）、C組（4000m組）、D組（6000m組）。對照組大鼠在屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組大鼠置于高原低壓環(huán)境模擬倉結(jié)合運(yùn)動的方式在艙

2、內(nèi)游泳槽進(jìn)行60 min/d的游泳運(yùn)動，且在高原低壓環(huán)境模擬艙內(nèi)生活時間每天不少于20小時。每組大鼠分別在第3、7、11、15d用Zea Longa5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行行為學(xué)評分并且于第15d采集靜脈血，在掃描電鏡下觀察紅細(xì)胞形態(tài)。每組處死后取腦組織進(jìn)行HE染色和TTC染色。模型制作成功后，分為3組即對照組:8只:HIE+PBS組（模型組）:8只，先制成HIE模型，然后給予PBS作為安慰治療;HIE+MSC組（治療組）:8只，先制成HIE

3、模型，然后給予MSC治療。分別于干預(yù)后第5、7、14、21天進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)檢測(Rotarod Test旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮測試)。21日后處死采用組織切片HE染色，觀察新生大鼠腦損傷的病理變化。
　　結(jié)果:1、神經(jīng)病學(xué)評分對照組行為正常，在行為學(xué)評分中為0分，而實(shí)驗(yàn)組大鼠行為學(xué)異常，主要表現(xiàn)為一側(cè)肢體感覺和運(yùn)動功能障礙和平衡功能的異常。實(shí)驗(yàn)組大鼠評分隨海拔升高而升高，行為異常程度與海拔高度呈正相關(guān)。并且實(shí)驗(yàn)組大鼠在第3、

4、7、11、15d行為學(xué)評分逐漸升高，這一數(shù)據(jù)表明長期生活中缺氧環(huán)境中會使腦損傷程度日趨加重，實(shí)驗(yàn)表明對照組與各實(shí)驗(yàn)組差異有顯著性意義（p＜0.05）海拔6000m組與對照組比較差異非常顯著(p＜0.01)。2、腦組織病理學(xué)改變對照組腦組織神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大小、外形正常，未出現(xiàn)腦水腫;在海拔2000m大腦皮質(zhì)輕度萎縮，神經(jīng)元細(xì)胞輕度水腫，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生;在海拔4000m大腦皮質(zhì)中度萎縮，神經(jīng)元細(xì)胞中度水腫，膠質(zhì)細(xì)胞中度增生;在海拔

5、6000m室管膜細(xì)胞重度水腫。3、TTC染色結(jié)果TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)是脂溶性光敏感復(fù)合物，它是呼吸鏈中吡啶—核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，而缺氧缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，故不會產(chǎn)生變化呈蒼白[16]。對照組TTC染色結(jié)果為紅色，未出現(xiàn)缺氧缺血表現(xiàn);海拔2000m出現(xiàn)輕度改變，大腦皮質(zhì)出現(xiàn)小片蒼白;海拔4000m大腦皮質(zhì)區(qū)可明顯看見蒼白區(qū)域;海拔6000m接近一半出現(xiàn)蒼白區(qū)。利用I

6、mage-Pro Plus做出海拔2000m組腦缺氧面積為26.6％，海拔4000m組腦缺氧面積為34.3％，海拔6000m組腦缺氧面積為56.6％，而對照組則為正常。4、電鏡下紅細(xì)胞在掃描電鏡下可以看見對照組紅細(xì)胞呈雙凹圓盤狀，在海拔2000m下電鏡表現(xiàn)為輕度改變呈帽狀結(jié)構(gòu);在海拔4000m下表現(xiàn)為不規(guī)則形;在海拔6000m下表現(xiàn)為鋸齒狀，部分紅細(xì)胞會出現(xiàn)空洞，崩解。間充質(zhì)干細(xì)胞給予治療:5、Rotarod Test結(jié)果顯示造模后第5

7、天模型組與治療組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅(jiān)持時間明顯下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);造模后第7、14、21天，模型組與治療組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅(jiān)持時間有升高趨勢，其中治療組升高趨勢明顯高于模型組(P＜0.05)，第21天模型組與治療組大鼠在轉(zhuǎn)輪中堅(jiān)持時間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。6、Morris水迷宮結(jié)果顯示3組大鼠的逃避潛伏期顯示隨訓(xùn)練天數(shù)增加而逃避時間逐漸縮短，前5天的總體學(xué)習(xí)成績的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)

8、。第7天開始治療組時間逐漸縮短，第21天治療組與模型組大鼠的逃避潛伏期在各個時間點(diǎn)的差異非常顯著。7、病理結(jié)果:模型組大鼠出現(xiàn)海馬區(qū)神經(jīng)元水腫、核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)不清、空泡形成等病理變化，而治療組病理損傷明顯減輕。
　　結(jié)論:本研究采用高原低壓環(huán)境模擬倉結(jié)合運(yùn)動模擬高原環(huán)境制作新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)的模型，該模型穩(wěn)定、可靠，比其他方法更符合缺血缺氧腦損傷的發(fā)病機(jī)理，與臨床貼近，可用于相關(guān)研究。間充質(zhì)干細(xì)胞治療后發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可