鞘蕊蘇二萜類生物合成機(jī)制與茅蒼術(shù)根莖、葉基因表達(dá)差異研究.pdf

1、本論文由兩部分組成，第一部分是鞘蕊蘇二萜類生物合成機(jī)制，第二部分是蒼術(shù)根莖、葉基因表達(dá)差異研究。
　　第一部分:鞘蕊蘇藥材藥用植物名為毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii(Wild) Briq)，系唇形科(Labiatae)鞘蕊花屬植物。野生毛喉鞘蕊花的發(fā)源地為印度次大陸，主要分布在印度、尼泊爾、緬甸、斯里蘭卡、泰國等亞熱帶國家，我國云南會(huì)澤、東川等地有少量發(fā)現(xiàn)植物學(xué)家界定為稀有物種。民間將該中草藥用于治療哮喘、咳嗽、腫

2、瘤等疾患，療效顯著。鑒于鞘蕊蘇的獨(dú)特療效。湖北福人藥業(yè)公司將其開發(fā)為“鞘蕊蘇膠囊”中藥新藥，獲得生產(chǎn)批件【批件號(hào)：2011S00365】。為了解決鞘蕊蘇膠囊產(chǎn)業(yè)化所需原料藥材的供求問題，湖北中醫(yī)藥大學(xué)劉焱文教授科研團(tuán)隊(duì)與湖北福人藥業(yè)公司產(chǎn)學(xué)研結(jié)合，從云南會(huì)澤縣移植鞘蕊蘇至湖北通城規(guī)范化種植。本論文對(duì)鞘蕊蘇5個(gè)二萜合成酶基因，即TPS1、TPS3、TPS4、TPS14和TPS15進(jìn)行克隆，并且研究其其特異性表達(dá)，以期提鞘蕊蘇藥材二萜有效成

3、分的含量，從而為通城種植鞘蕊蘇藥材培育優(yōu)良種質(zhì)提供了科學(xué)實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。
　　1、以鞘蕊蘇種子萌發(fā)2周左右的幼苗為試材，提取 RNA并去除 gDNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，行成克隆模板。以二萜相關(guān)基因不同合成途徑CPS和KS的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，通過引物特異性PCR克隆出保守區(qū)域堿基片段，再通過3’RACE和5’RACE分別進(jìn)行3’和5’端編碼區(qū)全長的擴(kuò)增，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，利用拼接的引物設(shè)計(jì)基因全長擴(kuò)增的引物，再次引物特異性PCR，最終

4、得到基因的全長序列?
　　2、對(duì)CfTPS14、CfTPS15的CDS序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過NCBI進(jìn)行BlastX比對(duì)分析，CfTPS14為映式貝殼杉烯合成酶，CfTPS15為映式柯巴基焦磷酸合成酶。CfTPS14等電點(diǎn)為5.38，分子式為C3987H6231N1073O1194S42，脂肪系數(shù)為91.35，主要平均疏水特性(GRAVY)為-0.189,表現(xiàn)為親水性，細(xì)胞定位其分布在細(xì)胞膜外?CfTPS15等電點(diǎn)為6.86

5、，分子式為 C3633H5629N993O1046S27，脂肪系數(shù)為87.65，主要平均疏水特性(GRAVY)為-0.371，表現(xiàn)為親水性，細(xì)胞定位在細(xì)胞膜外?
　　3、針對(duì)測(cè)序得到的二萜相關(guān)基因保守區(qū)域堿基序列設(shè)計(jì) qPCR引物，設(shè)計(jì)原則為擴(kuò)增長度：100-300 bp；引物長度：18±2；Tm值：54±1℃；引物自身沒有發(fā)卡結(jié)構(gòu)，引物之間不易形成二聚體結(jié)構(gòu)。分析結(jié)果表明，CfTPS1為柯巴基焦磷酸異構(gòu)體合成酶，CfTPS3、C

6、fTPS4為丹參酮二烯和13R淚柏醚合成酶， CfTPS14為映式貝殼杉烯合成酶， CfTPS15為映式柯巴基焦磷酸合成酶。CfTPS1和CfTPS3參與鐵銹醇前體丹參酮的合成，故CfTPS1和CfTPS3主要在根和根莖中表達(dá)，莖中含量較少；CfTPS3和CfTPS4參與佛斯柯林前體13R淚柏醚的合成，因此CfTPS3主要在根和根莖中表達(dá)，CfTPS4可能參與其他催化過程，因此在花和葉中含量較高；CfTPS14和CfTPS15參與次霉素

7、前體映式貝殼杉烯的合成，因此在花和葉中含量較高，在根中含量較低。上述研究表明，qPCR分析結(jié)果與基因特異性表達(dá)趨勢(shì)基本一致。
　　4、以CfTPS15基因的CDS設(shè)計(jì)引物，并加入 SalⅠ和NotI酶切位點(diǎn)，采用 PCR技術(shù)擴(kuò)增得到帶有酶切位點(diǎn)的基因 CDS序列,通過酶切位點(diǎn)將 CfTPS15與表載體 Pet28a連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞 BL21,再通過加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)CfTPS15基因的蛋白表達(dá)?
　　第二

8、部分:茅蒼術(shù)Atractylodes lancea(Thunb.) DC.(Compositae菊科)，是我國傳統(tǒng)常用藥材。茅蒼術(shù)的根莖具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目等功效。主要有效成分為蒼術(shù)素、β-桉葉醇、蒼術(shù)醇和蒼術(shù)酮等萜類化合物。由于市場對(duì)茅蒼術(shù)的需求與日俱增，茅蒼術(shù)野生資源受到掠奪性采挖，導(dǎo)致數(shù)量銳減。因此，人工種植已成為必由之路。而如何提高茅蒼術(shù)根莖產(chǎn)量、保證藥材質(zhì)量是人工種植要解決的首要問題。盡管茅蒼術(shù)的化學(xué)成分、藥理學(xué)、生理

9、生化、栽培技術(shù)等研究較多，根莖形成和生長的分子機(jī)制仍不清楚，很大一部分原因是缺乏茅蒼術(shù)基因組信息。近年來發(fā)展的高通量轉(zhuǎn)錄組技術(shù)為茅蒼術(shù)功能基因組研究提供了有效手段。
　　1、以江蘇茅山的茅蒼術(shù)為研究對(duì)象，對(duì)其根莖和葉的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序。構(gòu)建了茅蒼術(shù)總RNA的cDN文庫，采用Illumina HiSeq2000平臺(tái)對(duì)茅蒼術(shù)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序和從頭組裝。通過移除adaptor序列和低質(zhì)量的讀序后，分別從葉和根莖轉(zhuǎn)錄組得到118,397,

10、448和152,688,850 clean reads；總核苷酸數(shù)達(dá)33,885,787,250 bp(20 G)，平均讀序長度均為125 bp；在所有的茅蒼術(shù)樣品中共計(jì)有22,891條unigene表達(dá)，其中5,693條、4,502條、6,430條、3,504條和9,296條 unigene分別在2份葉樣品和3份根莖樣品中表達(dá)?？偣灿?9,664條序列（占所有unigene總數(shù)的42.90％）與 nr數(shù)據(jù)庫中已知的基因相匹配，這些數(shù)列

11、中的26,159(28.32%)條unigene被歸類到一個(gè)或多個(gè)GO項(xiàng)下。將 unigene映射到 KEGG數(shù)據(jù)庫的參考代謝通路，總計(jì)10,504條unigene被注釋，可歸入289條KEGG代謝途徑；161個(gè)Unigenes功能被注解為CYP450s，屬于71 CYP家族類；92366個(gè)Unigenes中確定了10103個(gè)SSR，其中1074個(gè)Unigenes包含兩個(gè)以上的微衛(wèi)星D NA,而且406個(gè)SSR存在于復(fù)合形式。
　

12、　2、茅蒼術(shù)葉和根莖轉(zhuǎn)錄組的特異性表達(dá)分析。在葉和根莖中轉(zhuǎn)錄豐度高的（FPKM>1000）的基因分別有227條和105條，其中有47條在兩種組織中共存。GO富集分析中，4,982DEGs映射到GO數(shù)據(jù)庫中，共有262個(gè) GO項(xiàng)目明顯富集。KEGG富集分析表明，1,158條上調(diào)的unigene與159條KEGG途徑相關(guān)聯(lián)，其中29條unigene歸于植物激素信號(hào)傳導(dǎo)(ko04075)，而多數(shù)unigene與淀粉和糖代謝(ko00500)、

13、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工（ko04141）和氨基酸的生物合成(ko01230)相關(guān)。將茅蒼術(shù)的測(cè)序結(jié)果與AGRIS數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，鑒別出42個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族；葉中共有60個(gè)轉(zhuǎn)錄子上調(diào)，根莖中共有67個(gè)轉(zhuǎn)錄子上調(diào)。
　　3、選擇20個(gè)差異性表達(dá)基因（DEGs）的qPCR驗(yàn)證RNA測(cè)序和計(jì)算結(jié)果表明，所有選擇的基因 qPCR相對(duì)表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄組分析具有相同的趨勢(shì)。測(cè)試了這些基因的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它們之間有顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.81。