兩種核糖體肽類天然產(chǎn)物的生物合成機(jī)制研究.pdf

1、Pantocin A(PA)是由成團(tuán)泛菌產(chǎn)生的一種能夠通過抑制L-組氨醇磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性從而阻斷組氨酸的生物合成RiPPs類天然產(chǎn)物，因此具有良好的抗導(dǎo)致果樹等火葉病的致病菌解淀粉歐文氏菌活性(Erwinia amylovora)。在2003年國外課題組已經(jīng)對PA的分子結(jié)構(gòu)，生物合成基因簇和可能的生物合成機(jī)制進(jìn)行相關(guān)報(bào)道，但PA生物合成的體外生化表征一直未見發(fā)表。鑒于PA分子獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)及其重要的生物活性，本文擬對PA的生物合成關(guān)鍵

2、催化機(jī)制進(jìn)行研究。我們從P. agglomerans基因組中成功克隆到參與PA分子生物合成的兩個(gè)關(guān)鍵基因paaA和paaB,隨后將paaA和paaB分別因克隆至pET28a表達(dá)載體，獲得表達(dá)質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)化E.coli BL21進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、親和純化。隨后將化學(xué)合成的前體肽PaaP作為反應(yīng)底物，擬對PaaA和PaaB蛋白進(jìn)行生物活性測試，與此同時(shí)國外研究組率先發(fā)表了PaaA在PA合成過程中通過Claisen縮合和脫羧形成雙環(huán)核心，鑒于

3、此，我們擬對PaaA/B蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，為深入揭示PaaA/B的催化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　Sactipeptide是由核糖體合成并經(jīng)過翻譯后修飾的一類多肽類天然產(chǎn)物，可表現(xiàn)出多種生理活性，此類化合物特有的標(biāo)志是在它們分子內(nèi)部存在一組或多組由半胱氨酸的巰基與另一氨基酸α-碳原子受體形成硫醚鍵。目前報(bào)道的Sactipeptide天然產(chǎn)物多來自于好氧芽孢桿菌，但通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)在某些厭氧菌如拜氏梭菌（C. beijer

4、inckii）中也發(fā)現(xiàn)了類似Sactipeptide生物合成基因簇。本課題中，我們將該基因簇中前體肽和修飾酶基因同時(shí)克隆至pRSFduet-1載體，并在在大腸桿菌中進(jìn)行異源共表達(dá)，對表達(dá)宿主進(jìn)行細(xì)胞裂解及親和純化，電泳檢測后質(zhì)譜鑒定純化產(chǎn)物，檢測到與預(yù)期分子量6372.19相差6.68Dal，根據(jù)SacA的氨基酸序列，推測可能是前體肽SacA分子內(nèi)的7個(gè)Cys形成3組分子內(nèi)二硫鍵而導(dǎo)致分子量減少6Dal。最后對修飾后的肽類進(jìn)行質(zhì)譜檢測和