構(gòu)建臨床相關(guān)的寡灶-多灶型轉(zhuǎn)移模型及miRNA-200c的高表達對寡灶轉(zhuǎn)移細胞株體外特性影響研究.pdf

1、背景：腫瘤轉(zhuǎn)移是造成死亡的重要原因。但在我們早期臨床和基礎(chǔ)研究展示了轉(zhuǎn)移灶數(shù)目有限（轉(zhuǎn)移病灶數(shù)<5或全身受累器官數(shù)<5）、穩(wěn)定或進展緩慢的寡灶型轉(zhuǎn)移是一個有異于進展迅速的多灶型轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移病灶數(shù)>5或全身受累器官數(shù)>5）的臨床診斷和治療的新實體。25％的寡灶型病人在接受寡灶型轉(zhuǎn)移針對性治療后能達治愈，而從寡灶向多灶型轉(zhuǎn)移的演變是治療失敗的根本原因。我們最近的臨床觀察顯示了 miR-200c的差異表達能夠分辯呈現(xiàn)穩(wěn)定寡灶型轉(zhuǎn)移和由寡灶向多灶

2、轉(zhuǎn)移演進的病人，預(yù)示miR-200c有可能是調(diào)控寡灶向多灶型轉(zhuǎn)移演進的重要機制之一。因此本課題欲從分子、細胞和腫瘤的不同層面，來闡明 miR-200C對促進腫瘤寡灶型向多灶型轉(zhuǎn)移演進的基因調(diào)控機制。
　　目的：建立與臨床相關(guān)的寡灶/多灶轉(zhuǎn)移動物模型并探索miR-200c對寡灶型轉(zhuǎn)移腫瘤細胞株體外特性的影響。
　　方法：首先，我們通過尾靜脈注射轉(zhuǎn)移能力強并帶有GFP表達的人乳腺癌細胞株MDA-MB-435建立與臨床相關(guān)的寡灶/

3、多灶轉(zhuǎn)移裸鼠模型，大約10~12周之后解剖裸鼠，用熒光鏡和470nm藍色激光手電筒能清晰看到體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移情況，擬獲取穩(wěn)定的寡灶型轉(zhuǎn)移和多灶型轉(zhuǎn)移的細胞株。由于 miRNA-200c在寡灶和多灶型轉(zhuǎn)移細胞中的表達差異明顯，故通過慢病毒感染建立穩(wěn)定高調(diào)miRNA-200c表達的寡灶型轉(zhuǎn)移細胞株（MDA-435-OL-200c），并同時建立陰性對照組（感染空質(zhì)粒LV3NC）和陽性對照組（多灶型細胞株），通過CCK-8增殖曲線測定、瓊脂平板克隆

4、實驗、transwell小室遷移和侵襲實驗來闡明高調(diào) miRNA-200c對寡灶型轉(zhuǎn)移細胞體外特性的影響以及高調(diào)目的基因后寡灶型與多灶型轉(zhuǎn)移細胞株體外特性的不同和聯(lián)系。
　　結(jié)果：⑴根據(jù)寡灶型和多灶型轉(zhuǎn)移的臨床定義，我們于肺上獲取了疑似寡灶型轉(zhuǎn)移和多灶型轉(zhuǎn)移的細胞株。并得到了除了肺以外的其他組織器官的寡灶和多灶的衍生細胞株，同時證實了我們建立的動物模型的穩(wěn)定性以及獲取的寡灶型轉(zhuǎn)移細胞和多灶型轉(zhuǎn)移細胞的穩(wěn)定性。⑵慢病毒感染miRNA

5、-200c質(zhì)粒后，經(jīng)流式篩選 GFP表達陽性細胞，熒光顯微鏡拍照驗證及熒光定量PCR復(fù)檢miRNA-200c的高調(diào)，確保了病毒感染的有效性，成功建立穩(wěn)定高表達miRNA-200c的寡灶型細胞株。⑶瓊脂平板克隆實驗結(jié)果顯示高調(diào)miRNA-200c的寡灶型細胞克隆斑形成率與陽性對照多灶型細胞相當(dāng)，而高于陰性對照實驗組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。⑷CCK-8細胞增殖曲線測定，發(fā)現(xiàn)三個組別細胞增殖能力相當(dāng)，增殖曲線重合率高且倍增時間相近。⑸trans

6、well小室遷移實驗結(jié)果顯示高調(diào) miRNA-200c后寡灶型細胞遷移能力上升，細胞活力與多灶型細胞相似，稍高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。6、transwell小室侵襲實驗結(jié)果如遷移實驗所述，P<0.05。
　　結(jié)論：①建立了與臨床相關(guān)的寡灶轉(zhuǎn)移與多灶轉(zhuǎn)移的動物模型，并獲取了穩(wěn)定的寡灶轉(zhuǎn)移細胞株和多灶轉(zhuǎn)移細胞株。②寡灶型細胞株穩(wěn)定高調(diào) miRNA-200c后體外特性研究描述中有一定程度上呈現(xiàn)出多灶型細胞株的特性，這與我們之前短

7、期高調(diào)寡灶細胞miRNA-200c后的研究結(jié)果吻合，說明 miRNA-200c有促進已有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。③通過前期研究及本課題研究，miRNA-200c高調(diào)后對單個寡灶轉(zhuǎn)移細胞存活能力及遷移、侵襲能力均有促進作用，說明miRNA-200c可能成為寡灶型轉(zhuǎn)移腫瘤針對性治療的新靶點。④對這一過程的調(diào)控miRNA-200c可能不是唯一的一個基因，并且miRNA-200c對寡灶型轉(zhuǎn)移到多灶型轉(zhuǎn)移的調(diào)控也可能不只是一個靶基因，