基于苦柯胺B多靶標(biāo)抗膿毒癥作用的分子設(shè)計、合成及生物活性研究.pdf

1、目的：膿毒癥（sepsis）是臨床上嚴(yán)重感染患者常見的致命性并發(fā)癥，發(fā)病率和病死率一直居高不下，迄今為止除了抗感染和抗休克等對癥治療措施以外，仍然沒有理想的特效治療手段。因此，臨床上對于抗膿毒癥藥物存在巨大需求?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實，膿毒癥是由于侵入人體的病原體釋放的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）被體內(nèi)相應(yīng)的模式識別受體（PRRs）結(jié)合與識別，引發(fā)全身性的過度炎癥反應(yīng)。統(tǒng)計顯示，在發(fā)生膿毒癥的患者體內(nèi)，90％以上的病原體為細菌，而細菌產(chǎn)生

2、的 PAMPs中毒性強、數(shù)量多、分布廣的PAMPs主要是內(nèi)毒素/脂多糖（LPS），細菌基因組 DNA（細菌非甲基化CpG DNA）以及肽聚糖（PGN）等。因此，以細菌產(chǎn)生的主要 PAMPs為靶標(biāo)拮抗膿毒癥是一條可行的治療策略。在這一策略指導(dǎo)下，利用生物傳感器定向垂釣技術(shù)，從中藥中發(fā)現(xiàn)了一個具有同時拮抗LPS和CpG DNA活性的先導(dǎo)化合物苦柯胺B（KB）。KB能夠結(jié)合并中和LPS和CpG DNA，阻斷它們與各自受體的結(jié)合，從而抑制炎癥反

3、應(yīng)，改善膿毒癥模型動物各項生理指標(biāo)，提高生存率。盡管KB的藥理活性與作用機制已經(jīng)得到證實，但其為何能同時作用于兩種靶標(biāo)尚不清楚。本課題擬通過分子相互作用的動力學(xué)和熱力學(xué)分析以及分子對接等手段揭示KB與LPS和CpG DNA的結(jié)合模式，闡明其結(jié)合作用機理，據(jù)此設(shè)計一系列衍生物，并進行生物學(xué)活性評價，以期發(fā)現(xiàn)具有更強活性的化合物，為開發(fā)更好的抗膿毒癥藥物奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.采用共振鏡生物傳感器，將LPS的活性中心li

4、pid A包被于芯片表面，檢測KB與lipid A的結(jié)合作用；采用雙偏振極化干涉儀（DPI），將CpG DNA包被于芯片表面，檢測KB與CpG DNA的結(jié)合作用；采用等溫滴定量熱儀（ITC），分別檢測KB與LPS和CpG DNA的結(jié)合作用；采用分子對接，分別分析KB與LPS和CpG DNA的結(jié)合模式。從分子結(jié)合動力學(xué)、熱力學(xué)以及計算機模擬等不同角度分析KB與LPS和CpG DNA的結(jié)合作用；
　　2.根據(jù)KB與LPS和CpG DN

5、A相互作用的結(jié)構(gòu)特征和模式，設(shè)計一系列KB衍生物，并采用基于分子對接和藥效團搜索的方法進行首輪虛擬篩選，從中遴選出活性預(yù)測較好的化合物進行合成；
　　3.通過共振鏡生物傳感器檢測KB衍生物與LPS和CpG DNA的結(jié)合作用；動態(tài)濁度法鱟試劑檢測KB衍生物（0.1和1μM）對LPS（5 ng/ml）引發(fā)鱟試劑凝集反應(yīng)的抑制作用；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測KB衍生物（0.3和1μM）對LPS（100 ng/ml）和CpG DNA

6、（10μg/ml）誘導(dǎo)RAW264.7細胞釋放細胞因子TNF-α的抑制作用。通過生物活性評價對合成的KB衍生物進行進一步的篩選，從中選擇活性最好的化合物進行體內(nèi)外活性評價；
　　4.對最終篩選出的KB衍生物H1，采用ELISA檢測H1（0.01~1μM）對LPS（100 ng/ml）和CpG DNA（10μg/ml）誘導(dǎo)RAW264.7細胞釋放細胞因子TNF-α的抑制作用；盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）建立膿毒癥小鼠模型，采用尾靜脈給藥

7、方式，觀察H1（1~10μg/kg）對模型小鼠的保護作用。
　　結(jié)果：
　　1.闡明了KB與LPS和CpG DNA的結(jié)合模式，KB主要以氫鍵和疏水作用與LPS和CpG DNA結(jié)合。KB與LPS結(jié)合的主要位點位于LPS的磷酸官能團，同時也與其脂肪酸和Kdo側(cè)鏈有結(jié)合作用；KB與CpG DNA結(jié)合的主要部位在于其GACGTT這一核心序列；
　　2.設(shè)計了9個系列共計31個KB衍生物，虛擬篩選預(yù)測衍生物E1和H1活性優(yōu)于KB

8、，對此進行了化學(xué)合成。此外，還選擇了預(yù)測活性與KB相當(dāng)?shù)腁1和活性顯著下降的SPM作為陰性對照進行了測試；
　　3.體外生物傳感器、鱟試劑檢測以及ELISA檢測結(jié)果從不同角度顯示，H1活性最好。在RAW264.7細胞模型上，對LPS和CpG DNA誘導(dǎo)釋放TNF-α的抑制作用分別比KB提高了1倍和5倍。在CLP模型動物上，H1顯著提高動物存活率，具有統(tǒng)計學(xué)差異，并呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。
　　結(jié)論：通過對KB與LPS和CpG