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1、研究背景及目的:
世界衛(wèi)生組織和歐美地區(qū)大規(guī)模的研究結(jié)果表明,藥物安全性問題是住院病人致死的最重要原因之一,占全部死亡原因的第五位[1,2]。硫嘌呤類藥物,如6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine,6-TG)和硫唑嘌呤(azathiopurine,AZA),是類嘌呤拮抗劑,能夠干擾核苷酸代謝,具有抗增殖和免疫抑制的作用。在臨床上這類藥物主要用于炎癥性腸炎、急性白血病
2、的化療或作為免疫抑制劑廣泛用于器官移植以及自身免疫性疾病的治療。硫嘌呤類藥物本身并無活性或活性很低,它們?cè)隗w內(nèi)需經(jīng)過酶催化生成6-硫鳥苷酸(6-thioguanine nucleotides,6-TGNs)而發(fā)揮藥理作用。硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(thiopurine S-methyltransferase,TPMT)是硫嘌呤類藥物在體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶,其編碼基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,S
3、NP)可以決定TPMT活性,進(jìn)而直接影響硫嘌呤類藥物的臨床療效和毒性的程度[2-4]。目前對(duì)于TPMT的檢測(cè)主要有表型及基因型兩種。表型檢測(cè)的準(zhǔn)確性受到輸血,藥物相關(guān)作用等因素的影響較為明顯?;蛐蜋z測(cè)不會(huì)受到上述因素的影響,同時(shí)也更為快速和簡(jiǎn)便。基因型檢測(cè)法正逐步取代表型檢測(cè)法,成為TPMT活性檢測(cè)的主流手段。如何快速、全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確的進(jìn)行TPMT基因型檢測(cè)是當(dāng)前的熱點(diǎn)問題。
本課題研究探索并優(yōu)化TPMT基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)
4、的最佳體系,制備了TPMT基因的37種SNP位點(diǎn)。尋找適合每一種SNP位點(diǎn)的內(nèi)切酶,并確定其被酶切后的片段大小。根據(jù)酶切后的片段大小、酶切時(shí)孵育的時(shí)間和溫度等條件來確定合適的內(nèi)切酶組合。
方法:
1.利用NCBI的GenBank查找TPMT基因全序列,然后從TPMT基因全序列中查找TPMT外顯子(exon)3-10的序列。合成TPMT外顯子3-10的特異性引物,并對(duì)反應(yīng)體系中引物濃度及PCR的退火溫度等進(jìn)行條件優(yōu)化,
5、建立聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增體系。利用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gelelectrophoresis,AGE)鑒定擴(kuò)增引物的特異性和擴(kuò)增片段的大小。
2.使用優(yōu)化后的PCR體系方法來擴(kuò)增TPMT exon3-10基因序列,然后將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行目的基因PCR克隆測(cè)序(要求提供克隆測(cè)序結(jié)果、宿主菌和純化好的質(zhì)粒。對(duì)純化后的質(zhì)粒具有如下要求:每種質(zhì)粒至少
6、提供1毫升,濃度為1 x10E7 copies/ul以上,拷貝數(shù)越大越好。同時(shí)要求PCR產(chǎn)物末端帶有A尾。)。用BLAST軟件把克隆測(cè)序結(jié)果和模板序列進(jìn)行比對(duì),以確定擴(kuò)增出的外顯子序列的正確性。比對(duì)無誤后進(jìn)行點(diǎn)突變,依據(jù)37種不同的SNP位點(diǎn),將序列中的一個(gè)堿基突變成另一個(gè)堿基。具體的堿基突變位置如下:Exon3(TPMT*03E: rs3931660 T140+114A、TPMT*13E: rs72552742 A83T、TPMT*1
7、4:rs9333569 A1G、TPMT*17: ND C124G、TPMT*29:rs267607275 T2C、TPMT*30: ND G106A); Exon4(TPMT*03E: rs12529220A141-101T、TPMT*5:rs72552740 T146C、TPMT*18:ND211G>A、TPMT*21:rs200591577 C205G);Exon5(TPMT*02: rs1800462 G238C、TPMT*03
8、D: rs72552739G292T、TPMT*03E: rs2518463 T366+58C、TPMT*09: rs151149760 A356C、TPMT*19:ND A356C、 TPMT*27: ND T319G、TPMT*28: ND G349C、TPMT*32: rs115106679G340A、TPMT*34: rs111901354 C244T);Exon6(TPMT*11:rs72552738 G395A、TPMT*1
9、2: ND C374T); Exon7(TPMT*03B: rs1800460 G460A、TPMT*03E: rs2842934C474T、TPMT*10: rs72552737 G430C、TPMT*16:rs144041067 G488A、TPMT*22:ND G488C、TPMT*33:rs112339338 C487T);Exon8(TPMT*15:rs9333570 G495-1A、TPMT*06:rs75543815 A5
10、39T、TPMT*23:rs74423290 C500G、TPMT*24:rs6921269G537T);Exon9(TPMT*26: rs72556347T622C、TPMT*31: rs79901429 T611C);Exon10(TPMT*04:rs1800584 G626-1A、TPMT*03C: rs1142345: A719G、TPMT*07:rs72552736 T681G、TPMT*08:rs56161402 G644A
11、、TPMT*20:rs150900439 A712G、TPMT*25: ND T634C)。野生型序SNP列采用pUCm-T質(zhì)粒載體,此載體是為簡(jiǎn)化PCR產(chǎn)物的克隆而設(shè)計(jì)的,適用于3'-末端帶有A尾的PCR產(chǎn)物克隆。突變型SNP序列使用pUC57質(zhì)粒作為載體。共制備了37種TPMT基因SNP位點(diǎn)。
3.利用DNAssist軟件分析查找TPMT37種SNP位點(diǎn)最合適的內(nèi)切酶,但其中有10個(gè)SNP位點(diǎn)沒有找到合適的內(nèi)切酶。因此通過
12、錯(cuò)配堿基的方法(使用primerprimer5軟件來設(shè)計(jì)錯(cuò)配堿基的引物)確定合適的酶。利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切后的片段的大小。通過酶切后的片段大小、內(nèi)切酶的孵育時(shí)間和溫度等條件對(duì)內(nèi)切酶進(jìn)行組合,同時(shí)要求同一組合中酶切后的片段的大小至少相差5 bp。
結(jié)果:
1.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)確定最優(yōu)的反應(yīng)條件為:引物濃度為0.4μM,探針濃度為0.1μM,退火溫度為55℃。
2.將得到的8個(gè)外顯子PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆并
13、依次測(cè)序,通過與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行對(duì)比確定得到的各個(gè)外顯子序列的正確性。經(jīng)過BLAST比對(duì),兩者序列匹配。克隆出的TPMT外顯子為野生型序列。為了得到突變型序列,我們依據(jù)突變型的TPMT SNP位點(diǎn)分布,對(duì)不同的SNP位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變。通過這一步驟得到了突變型的TPMT SNP序列。通過上述步驟成功構(gòu)建了TPMT基因的37種SNP位點(diǎn)(野生型和突變型)。
3.使用不同的內(nèi)切酶切來識(shí)別TPMT基因的37種SNP位點(diǎn),利用瓊脂糖凝膠電泳鑒
14、定酶切片段的大小。通過分析酶切后的片段大小、酶切孵育的時(shí)間和溫度對(duì)其不同的酶進(jìn)行合理組合,使其可以全面、更快的判斷來未知樣本的SNP位點(diǎn)情況。
結(jié)論:
1.本研究?jī)?yōu)化了TPMT基因外顯子3-10擴(kuò)增反應(yīng)體系,利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定了TPMT基因外顯子3-10擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性。
2.利用不同的質(zhì)粒載體構(gòu)建了37種野生型和突變型TPMT基因SNP位點(diǎn)。
3.獲取了37種SNP位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的內(nèi)切酶,確定了
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