大鱗副泥鰍尾鰭再生相關(guān)基因PdGig2和PdFrr2的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、發(fā)育成熟的個(gè)體在受損后可以在原有組織基礎(chǔ)上重建已丟失的組織，這種現(xiàn)象稱為再生。所有生物體對(duì)組織損傷會(huì)做出相應(yīng)的生理反應(yīng)，同時(shí)與疾病的發(fā)生又密切相關(guān)，因此研究再生的過(guò)程和機(jī)制具有重要的意義。哺乳類動(dòng)物再生能力非常有限，而以蠑螈為代表的有尾兩棲類和以斑馬魚為代表的硬骨魚能夠在附肢及魚鰭截?cái)嗪笸ㄟ^(guò)割處再生完成結(jié)構(gòu)和功能的重建。但兩棲類繁殖速度慢，實(shí)驗(yàn)室不易飼養(yǎng)，且缺乏相應(yīng)的遺傳操作技術(shù)，不能成為理想的研究動(dòng)物。魚鰭在切斷后卻能夠完整的恢復(fù)原有

2、結(jié)構(gòu)，并且相對(duì)簡(jiǎn)單，易獲得，損傷后不危害機(jī)體生命，更具意義的是硬骨魚魚鰭與人類在內(nèi)的四足動(dòng)物肢體早期發(fā)育極其相似，但二者再生能力卻大不相同，因此魚鰭可以作為解析分子再生機(jī)制的良好體系。
　　本研究先是從已經(jīng)建立的抑制性消減雜交文庫(kù)中篩選得到兩個(gè)魚鰭再生差異表達(dá)明顯很大的ESTs，在這兩個(gè)ESTs的基礎(chǔ)上，采用RACE的方法進(jìn)行擴(kuò)增，得到兩個(gè)cDNA全長(zhǎng)序列。通過(guò)Blast比對(duì)后，其中一個(gè)基因認(rèn)為是Gig2基因，另一個(gè)Blast結(jié)果

3、并未發(fā)現(xiàn)有與高度同源的，認(rèn)為是一個(gè)新基因，將其命名為Frr2基因。隨后利用DNAMAN，MEGA6.0，sigmaplot等軟件對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行生物學(xué)分析，還測(cè)定了這兩個(gè)基因在不同組織中的表達(dá)。
　　Gig2基因是草魚出血性病毒誘導(dǎo)的基因2，它首先是從紫外失活的GCHV處理的鯽魚囊胚細(xì)胞中鑒定獲得的一個(gè)新基因。它在魚類干擾素抗病毒反應(yīng)中起著重要作用，而在再生中能夠調(diào)節(jié)再生則可能是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)。它c(diǎn)DNA全長(zhǎng)是712bp，共編碼156

4、個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為17.324KDa，等電點(diǎn)(pI)8.69。46個(gè)極性氨基酸，71個(gè)非極性疏水氨基酸，18個(gè)酸性氨基酸，21個(gè)堿性氨基酸。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)α-螺旋占23.72％，延伸鏈占27.56％，β-轉(zhuǎn)角占16.03％，無(wú)規(guī)卷曲占32.69％。通過(guò)半定量以及熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn):在再生后4d表達(dá)達(dá)到最高水平，在胚胎發(fā)育時(shí)期的出膜期表達(dá)量最高，還發(fā)現(xiàn)在精巢組織表達(dá)也是最大的。根據(jù)Gig2的表達(dá)模式我們首次發(fā)現(xiàn)了該基因參與到了魚鰭

5、再生的過(guò)程，它可能在魚鰭結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中起著調(diào)控作用。同源度結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)Gig2基因與其他物種的同源度相對(duì)并不是很大，這也使得研究其進(jìn)化關(guān)系引起很大興趣。
　　Frr2(fin regeneration related gene2)基因是一個(gè)未知基因，它是一個(gè)與魚鰭再生相關(guān)的一個(gè)基因。cDNA全長(zhǎng)為1036bp，編碼了有88個(gè)氨基酸，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其中α螺旋占46.59％，β-轉(zhuǎn)角占9.09％，無(wú)規(guī)卷曲占32.95％，延伸鏈占11.3

6、6％。半定量以及熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在再生不同時(shí)期(0dpa，2dpa，3dpa，4dpa，5dpa，6dpa)的第四天表達(dá)最高，在不同組織(肝、心、腦、精巢、腎、卵巢)中心臟表達(dá)水平較高，胚胎不同發(fā)育時(shí)期(囊胚期，原腸胚，神經(jīng)胚，尾芽期，出膜期)原腸胚期的基因表達(dá)水平最高。冰凍切片把處于再生不同時(shí)期的尾鰭進(jìn)行原位雜交。原位雜交結(jié)果顯示:發(fā)現(xiàn)在魚鰭內(nèi)部成骨細(xì)胞中有表達(dá)，在4dpa表達(dá)信號(hào)最強(qiáng)。我們推測(cè)Frr2基因可能參與到了成骨細(xì)胞的增殖和