不同來源干細(xì)胞構(gòu)建組織工程支架移植治療胚胎期脊柱裂的實驗研究.pdf

1、目的：
　　神經(jīng)管畸形(neural tube defects，NTDs)是一種復(fù)雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的先天畸形，繼發(fā)于胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)管閉合不全。目前，NTDs的全球的發(fā)病率為1‰。中國是神經(jīng)管畸形的高發(fā)地區(qū)，每年約有80000至100000例新生兒被診斷患NTDs。脊柱裂是最常見和最嚴(yán)重的神經(jīng)管畸形類型之一。隨著臨床診療技術(shù)的發(fā)展，顯性脊柱裂患兒的生存率明顯提高，但神經(jīng)功能障礙改善并不明顯，嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量。脊柱裂可以沿脊

2、柱的任何部位發(fā)生，存在脊髓神經(jīng)、脊椎骨和皮膚的缺損。組織工程技術(shù)的日益發(fā)展為我們提供了新的思路，目前有許多疾病可以結(jié)合組織工程的方法得到較好的治療。另外，干細(xì)胞移植修復(fù)的基礎(chǔ)是神經(jīng)元的再生或是有缺陷脊髓細(xì)胞的替代，這將為脊柱裂患者的功能恢復(fù)提供較大應(yīng)用前景。有報道顯示干細(xì)胞移植可應(yīng)用于先天性血液系統(tǒng)疾病和免疫缺陷病的治療，并在脊髓脊膜膨出(MMC)的胎羊模型中也有應(yīng)用。因此，利用組織工程支架和干細(xì)胞移植技術(shù)可以對多種組織結(jié)構(gòu)的缺損進(jìn)行修

3、復(fù)重建，有望成為有潛在應(yīng)用前景的治療方法。
　　綜上所述，本實驗采用移植神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合殼聚糖-明膠支架材料對脊柱裂胎鼠進(jìn)行產(chǎn)前治療，并與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合殼聚糖-明膠支架材料及移植兩種干細(xì)胞的效果進(jìn)行比較;通過進(jìn)一步在顯微鏡下觀察綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量，并用免疫熒光法判斷細(xì)胞在體內(nèi)存活及分化情況最終確定最有效的治療方法。
　　方法：
　　一、材料與儀器
　　實驗主要材料包括殼聚糖-明膠支架（天津中醫(yī)藥大學(xué)提供）、

4、超凈臺、5％ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)、水浴箱、天平、倒置顯微鏡、手術(shù)顯微鏡、熒光顯微鏡、自動顯微照相分析系統(tǒng)、冰凍切片機(jī)、共聚焦掃描顯微鏡、青霉素、鏈霉素、全反式維甲酸、10％水合氯醛、DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清、重組腺病毒載體（rAd5F35-mCMV-EGFP）、巢蛋白抗體(nestin)、早期神經(jīng)元表面特異性標(biāo)記物微管蛋白(tubulin)、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物(GFAP)、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基。
　　二、方法

5、>　　應(yīng)用懸浮法培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞以及全骨髓細(xì)胞貼壁篩選法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)至三代后將rAd5F35-mCMV-EGFP病毒載體轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)，將表達(dá)綠色熒光蛋白的兩種干細(xì)胞與殼聚糖明膠支架材料在體外進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的復(fù)合支架以及干細(xì)胞分別應(yīng)用顯微外科和胎仔外科技術(shù)移植到妊娠第16天的先天性顯性脊柱裂胎鼠的脊髓缺損部位，然后在懷孕第20天時取出手術(shù)胎鼠并觀察其被修復(fù)的情況，并用4％的多聚甲醛進(jìn)行心臟灌

6、注固定，蔗糖梯度脫水，然后進(jìn)行冰凍連續(xù)切片，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測干細(xì)胞在脊髓組織中的存活和分化情況。
　　結(jié)果：
　　一、神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的分離培養(yǎng)及鑒定
　　提取孕14天胎鼠大腦海馬區(qū)及腦下室區(qū)等部分腦組織的干細(xì)胞，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，接種后在相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈懸浮球狀單個存在，邊界清楚，折光性強(qiáng)。37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)24小時后部分神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生聚集，3天后可見較大神經(jīng)球形成，并且可見一些細(xì)胞碎片和

7、貼壁的雜細(xì)胞。傳代培養(yǎng)至第三代以后，神經(jīng)干細(xì)胞純度可達(dá)90％以上，形態(tài)穩(wěn)定，可見神經(jīng)球透光性較好，邊緣折光性強(qiáng)。將第三代后的神經(jīng)球吹打至單細(xì)胞懸液進(jìn)行Nestin免疫熒光染色鑒定，可見神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)紅色熒光的Nestin。
　　二、宮內(nèi)移植手術(shù)和胎鼠存活情況
　　本實驗使用Wistar大鼠在孕第10天時經(jīng)胃管給予全反式維甲酸制作NTDs模型，在妊娠第16天時進(jìn)行宮內(nèi)移植手術(shù)，總計手術(shù)孕鼠82只，手術(shù)胎鼠254只，共有153只

8、成活（成活率為60.24％），其中NSCs復(fù)合支架組手術(shù)62只胎鼠，存活33只（成活率53.23％）;BMSC復(fù)合支架組手術(shù)54只胎鼠，存活28只（存活率51.85％）;NSCs組手術(shù)55只胎鼠，存活36只（存活率65.45％）;BMSC組手術(shù)51只，存活32只（存活率62.75％）。支架組的存活率要低于干細(xì)胞移植組，原因可能為支架移植過程更加困難，對胚胎創(chuàng)傷較大所致。
　　三、宮內(nèi)移植干細(xì)胞后在脊柱裂胎鼠體內(nèi)的存活情況
　

9、　根據(jù)對各組移植到脊柱裂胎鼠體內(nèi)的GFP陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計數(shù)，NSCs復(fù)合支架組平均值為827個/胎（10胎總計8270個），NSCs組平均值為522個/胎（10胎總計5216個），復(fù)合支架移植組明顯高于細(xì)胞移植組。
　　四、復(fù)合支架移植體內(nèi)后的分化情況
　　根據(jù)GFP陽性細(xì)胞表達(dá)Tubulin及GFAP的數(shù)量，判斷干細(xì)胞分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的情況。實驗結(jié)果表明干細(xì)胞移植后在體內(nèi)可以向神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，不同方法

10、向神經(jīng)元的分化率分別為:NSCs復(fù)合支架組為14.90％(327/2103)，BMSC復(fù)合支架組為9.15％(201/2111)，NSCs組為15.27％(209/1340)，BMSC組為10.34％(136/1312);向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化率為:NSCs復(fù)合支架組為21.35％(441/2069)，BMSC復(fù)合支架組為20.10％(403/2006)，NSCs組為22.38％(288/1289)，BMSC組為21.00％(264/12

11、42); NSCS向神經(jīng)元的分化率高于BMSCs(P＜0.01)，而向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化無明顯差異（P＞0.05）
　　五、胎鼠脊柱裂部位缺損修復(fù)情況
　　對NSCs復(fù)合支架治療組與空白對照組的胎鼠脊柱裂部位缺損面積進(jìn)行比較，結(jié)果顯示NSCs復(fù)合支架組的缺損面積較空白對照組缺損面積有縮小趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;對NSCs組與空白對照組的胎鼠脊柱裂部位缺損面積進(jìn)行比較，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。