hMOB2對HepG2細(xì)胞遷移、侵襲以及與ECM黏附影響的研究.pdf

1、目的:人單極紡錘體1結(jié)合蛋白2(human monopolar spindle-one-binder2，hMOB2)是hMOB蛋白家族成員之一，研究顯示，hMOB2可以調(diào)控細(xì)胞中細(xì)胞核-Dbf2相關(guān)激酶(NDR)的活性，影響中心體復(fù)制、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等過程，但是hMOB2的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移的關(guān)系尚未見報道。本研究的目的就是研究hMOB2是否影響肝癌細(xì)胞HepG2的遷移和侵襲以及與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的黏附，初步闡明hMOB

2、2調(diào)控HepG2細(xì)胞遷移、侵襲的作用方式及機(jī)制。
　　方法:以HepG2細(xì)胞為研究對象，采用慢病毒介導(dǎo)的基因過表達(dá)和RNA干擾等手段，在細(xì)胞中過量表達(dá)hMOB2以及干擾細(xì)胞內(nèi)hMOB2表達(dá)，研究hMOB2對HepG2細(xì)胞與ECM黏附、遷移和侵襲的影響。
　　(1)利用RT-qPCR和Westem blot方法檢測過表達(dá)和干擾表達(dá)后的細(xì)胞中hMOB2的mRNA水平和蛋白水平，并檢測hMOB2對FAK、Src和paxillin的

3、表達(dá)以及活性的影響。
　　(2)分別利用MTT和CCK-8方法檢測慢病毒介導(dǎo)的hMOB2基因過表達(dá)和RNA干擾表達(dá)等對HepG2細(xì)胞活力的影響。
　　(3)分別利用Transwell細(xì)胞遷移實驗和細(xì)胞侵襲實驗研究hMOB2對HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的影響。
　　(4)利用腫瘤細(xì)胞與Ⅰ型膠原的黏附實驗以及細(xì)胞鋪展實驗研究hMOB2對HepG2細(xì)胞與ECM黏附以及在基質(zhì)上鋪展的影響。
　　(5)利用免疫熒光實驗觀察h

4、MOB2對HepG2細(xì)胞中黏著斑復(fù)合體的形成和肌動蛋白纖維的分布、張力纖維裝配、絲狀和片狀偽足形成等的影響。
　　結(jié)果:RT-qPCR和Western blot實驗結(jié)果表明，LV-hMOB2慢病毒感染后的HepG2細(xì)胞中hMOB2過表達(dá)，LV-sihMOB2-4感染HepG2細(xì)胞后可以有效地敲低hMOB2的表達(dá)，因此LV-hMOB2和LV-sihMOB2-4（后續(xù)用LV-sihMOB2命名）慢病毒可用于后續(xù)細(xì)胞水平的實驗。

5、　　(1)MTT實驗和CCK-8實驗結(jié)果顯示，與空白對照(Mock)、對照慢病毒(LV-CTL)和對照RNA干擾慢病毒(LV-siCTL)感染組相比，hMOB2過表達(dá)(LV-hMOB2組)和RNA干擾表達(dá)（LV-siMOB2組）對HepG2細(xì)胞的活力無明顯影響。
　　(2)Transwell細(xì)胞遷移實驗和細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果顯示，hMOB2過表達(dá)極顯著抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲過程(p＜0.01)，而RNA干擾敲低hMOB2表達(dá)也

6、可以抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲(p＜0.05)。
　　(3)腫瘤細(xì)胞與Ⅰ型膠原黏附實驗結(jié)果顯示，hMOB2過表達(dá)可以顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞與基質(zhì)的黏附(p＜0.01)，而RNA干擾敲低hMOB2表達(dá)則可以抑制HepG2細(xì)胞與基質(zhì)的黏附(p＜0.05);另外，細(xì)胞鋪展結(jié)果也顯示，hMOB2過表達(dá)可以影響HepG2細(xì)胞在Ⅰ型膠原上的鋪展。
　　(4)免疫熒光染色細(xì)胞中paxillin，結(jié)果顯示，hMOB2過表達(dá)可以促進(jìn)黏著斑

7、的形成，與空白對照(Mock)、對照慢病毒(LV-CTL)和對照RNA干擾慢病毒(LV-siCTL)感染組相比，過表達(dá)hMOB2的細(xì)胞中黏著斑的數(shù)量和大小都顯著增加，并分散分布于整個細(xì)胞;而RNA干擾敲低hMOB2表達(dá)則可以抑制HepG2細(xì)胞中黏著斑的形成，并主要分布在細(xì)胞周圍。利用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色細(xì)胞中的肌動蛋白纖維，結(jié)果顯示，過表達(dá)hMOB2的HepG2細(xì)胞中張力纖維粗大、數(shù)目增多，細(xì)胞邊緣的絲狀偽足和片狀偽足顯著減少，而R

8、NA干擾敲低hMOB2表達(dá)則可以抑制HepG2細(xì)胞中張力纖維的形成，F(xiàn)-actin集中分布在細(xì)胞周圍或邊緣。
　　(5)Western blot實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)hMOB2可以上調(diào)HepG2細(xì)胞中pY397FAK、pY925FAK和pY118paxillin，下調(diào)pY527Src;而RNA干擾敲低hMOB2表達(dá)則可以下調(diào)HepG2細(xì)胞中pY397FAK、pY925FAK和pY118 paxillin，但對pY527Src無顯著影

9、響。無論過表達(dá)還是干擾表達(dá)hMOB2對細(xì)胞中總的FAK、Src和paxillin的表達(dá)均無顯著影響。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果表明:
　　(1)過表達(dá)hMOB2抑制細(xì)胞的遷移和侵襲很可能是由于hMOB2過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞與ECM的過度黏附所致，而RNA干擾敲低hMOB2表達(dá)抑制細(xì)胞遷移和侵襲有可能是下調(diào)hMOB2表達(dá)負(fù)調(diào)控細(xì)胞與ECM黏附的結(jié)果。
　　(2)hMOB2過表達(dá)和干擾表達(dá)對HepG2細(xì)胞遷移、侵襲以及對細(xì)胞與ECM