GRK3在雄激素剝奪療法誘導的神經內分泌型前列腺癌中的作用研究.pdf

1、前列腺癌是非常常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在西方國家也是最常見的惡性腫瘤，尤其在美國，前列腺癌患者的發(fā)病率仍超過肺癌，高居第一位。近年來，在我國前列腺癌患者發(fā)病率逐漸呈增長趨勢。前列腺癌由于癥狀隱蔽，至少50％的患者確診時已為局部晚期腫瘤，治療并預防轉移對提高生存率尤為重要。轉移和復發(fā)也是患者死亡的主要原因。神經內分泌細胞已被公認為是正常前列腺管道和腺泡的一個組成部分。近50％的臨床型前列腺癌有神經內分泌細胞異變。神經內分泌型前列腺

2、癌(neuroendocrine differentiation of prostate cancer, NEPC)，也稱為未分化小細胞癌，是一種高侵襲性前列腺癌的亞型。它可以是原發(fā)性的，但其大多數(shù)來自前列腺腺癌(Prostate adenocarcinoma, PCA)的晚期并進行激素治療之后。神經內分泌型前列腺癌NEPC不同于前列腺癌PCA，NEPC的特點是存在神經內分泌(neuroendocrine，NE)細胞、不表達雄激素受體(

3、androgenreceptor, AR)、不分泌前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)，但通常高表達神經內分泌標志物，如嗜鉻粒蛋白A(chromogranin A，CHGA)嗜鉻粒蛋白B(chromogranin B，CHGB)，突觸小泡蛋白，特定神經元烯醇酶2(enolase2，ENO2)。臨床研究表明，患者長期應用雄激素剝奪療法（androgen deprivation therapy，AD

4、T）可誘導細胞發(fā)生神經內分泌轉。因此去勢抵抗型前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)的發(fā)生率，可能會隨著臨床引入雄激素剝奪療法的增加而增加，導致一個高侵襲性、高轉移性的臨床過程。因此，闡明NEPC發(fā)生的分子機制以及開發(fā)NEPC的靶向治療藥物是目前前列腺癌領域的一個研究熱點。
　　最新研究表明，人類G蛋白耦合受體激酶3(G protein-coupled receptorkin

5、ases3，GRK3)是前列腺癌細胞轉移過程中所必不可少的激酶，促進前列腺癌細胞轉移過程。因為NEPC是具有高轉移性質的一種前列腺癌的亞型，因此，我們考慮是否GRK3在前列腺腺癌細胞的NE分化過程中是否也發(fā)揮了重要的作用。
　　本研究中，我們通過無激素培養(yǎng)誘導前列腺腺癌細胞LNCaP向NE方向轉化，制備了雄激素剝奪療法(Androgen deprivation treatment，ADT)誘導的神經內分泌型前列腺癌細胞，命名為t-

6、NEPC(ADT-induced NEdifferentiated cell line)。并研究了LNCaP向t-NEPC細胞轉化的過程當中蛋白激酶GRK3的作用。該研究的目的是為了NEPC的治療提供新的治療靶點和實驗依據(jù)。
　　目的:制備ADT誘導的神經內分泌型前列腺癌細胞，并研究在前列腺腺癌細胞向神經內分泌轉化的過程中蛋白激酶GRK3的作用，為NEPC的治療提供新的治療靶點和實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、細胞培養(yǎng)

7、
　　人類前列腺腺癌LNCaP細胞在含5％的胎牛血清、濃度分別為1％的谷氨酰胺和1％的青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
　　t-NEPC細胞在含5％的無激素胎牛血清、濃度分別為1％的谷氨酰胺和1％的青霉素和鏈霉素的無激素RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
　　2、實驗方法
　　采用無激素RPMI1640培養(yǎng)基誘導人類前列腺腺癌LNCaP細胞向神經內分泌方向轉化，成功制備人前列腺腺癌細胞來源的神經內分泌t

8、-NEPC細胞，采用Real time PCR檢測兩種細胞當中PSA、AR以及NE標志物CHGA、CHGB和ENO2的表達變化，通過Real time PCR和westernblot方法檢測兩種細胞中GRK3的表達變化。采用病毒感染方法建立穩(wěn)定表達shGRK3的t-NEPC細胞，并采Real time PCR方法檢測敲低GRK3后t-NEPC細胞中NE標志物CHGA、CHGB和ENO2的表達變化。
　　結果:
　　1、ADT

9、可誘導人類前列腺腺癌LNCaP細胞向神經內分泌方向分化
　　首先我們通過在去激素的RPMI1640，含5％的胎牛血清、濃度分別為1％的谷氨酰胺和1％的青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基中，長期培養(yǎng)LNCaP細胞從而得到t-NEPC細胞。這些細胞是來源于長期用ADT治療的人類前列腺腺癌LNCaP細胞。結果顯示，LNCaP細胞顯示上皮形態(tài)，而t-NEPC細胞可見包體變圓，周圍出現(xiàn)很多神經元樣細胞突觸，細胞形態(tài)發(fā)生了變化。我們又通過實時定量PCR在

10、LNCaP和t-NEPC這兩個細胞系中比較 AR的表達以及其目標基因前列腺特異性抗原(PSA)兩種NE標記物的表達。結果顯示，PSA在LNCaP細胞中的表達比在t-NEPC細胞中高出10倍，AR在LNCaP細胞比在t-NEPC胞中的表達也高出了5倍，在LNCaP細胞中CHGA上升了6倍，CHGB上升了4倍，ENO2上升了20倍。
　　2、GRK3在人類前列腺腺癌向神經內分泌方向分化的表達變化
　　我們研究了GRK3在LNCa

11、P和t-NEPC細胞中的表達。Western-blot結果顯示與LNCaP細胞相比GRK3在ADT-誘導的t-NEPC細胞中的蛋白水平明顯升高;而通過實時定量PCR檢測結果顯示，ADT-誘導的t-NEPC細胞與LNCaP細胞相比顯著上升了兩倍.
　　3、敲除GRK3后對t-NEPC表型的影響
　　我們用GRK3 shRNA感染t-NEPC細胞后，首先觀察了細胞的形態(tài)變化，細胞轉染GRK3 shRNA后，細胞觸角減少，形態(tài)發(fā)生

12、逆轉變化，然后我們又通過實時定量PCR方法檢測了t-NEPC shscramble和t-NEPCshGRK3以此評估敲除GRK3實驗是否成功，結果顯示:t-NEPC shGRK3組的表達明顯低于對照組t-NEPC shscramble3倍，GRK3 shRNA被感染成t-NEPC細胞減少了內源性GRK3，GRK3敲除成功。我們進一步進行了NE標志物:CHGA CHGB和ENO2的表達，通過實時定量PCR分析t-NEPC shGRK3較對