釀酒酵母Rad52基因轉(zhuǎn)化擬南芥及轉(zhuǎn)化體篩選技術(shù)研究.pdf

1、基因打靶是反向遺傳學(xué)基因功能研究的重要工具，但在植物轉(zhuǎn)基因過程中，外源基因絕大多數(shù)隨機插入基因組中，通過同源重組定向插入的概率極低。近年來雖采用了多種方法提高基因打靶的效率，目前仍沒有達到實用水平。釀酒酵母轉(zhuǎn)基因主要通過同源重組的方式整合到基因組中，因而具有很高的打靶效率。把酵母等生物的同源重組機制引入植物可能是提高植物基因打靶效率的有效的途徑。Rad52蛋白是酵母與同源重組有關(guān)的關(guān)鍵酶，而絕大多數(shù)植物缺乏Rad52蛋白。本研究的主要目

2、的就是從酵母中克隆出Rad52基因，并把它導(dǎo)入到模式植物擬南芥中，以便進一步研充Rad52基因?qū)χ参锿粗亟M及基因打靶效率的影響。 目前植物基因打靶的效率非常低，研究基因打靶需要建立非常有效的植物轉(zhuǎn)基因體系。擬南芥轉(zhuǎn)基因可以采用活體(原位)轉(zhuǎn)化法，在轉(zhuǎn)化階段可以完全不依賴組織培養(yǎng)技術(shù)，轉(zhuǎn)化步驟簡單、高效。但轉(zhuǎn)基因種子的篩選基本上還依賴于無菌培養(yǎng)，工作量比較大，而且容易污染，造成實驗材料的損失。本研究在前人技術(shù)的基礎(chǔ)上，著重對種

3、子篩選技術(shù)做了改進，提出了三種不依賴于無菌培養(yǎng)的簡單、可靠和高效的轉(zhuǎn)基因種子篩選方法。 本研究的主要結(jié)果如下： 1.從酵母基因組中克隆出同源重組關(guān)鍵基因Rad52，構(gòu)建出農(nóng)桿菌雙元載體，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法導(dǎo)入擬南芥野生生態(tài)型Columbia。獲得的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR鑒定證實，Rad52基因已整合到基因組中。 2.提出了三種不依賴無菌培養(yǎng)的擬南芥轉(zhuǎn)基因種子篩選方法。其一是濾紙發(fā)芽篩選法，轉(zhuǎn)基因種子在含有篩

4、選劑的1/4MS大量元素液體的濾紙上進行發(fā)芽篩選。其二是水瓊脂發(fā)芽篩選法，用含篩選劑的1/4MS大量元素加0.8％的瓊脂固化，由于水瓊脂不含蔗糖和其他有機物質(zhì)，加上抗菌素的作用，細菌不會在短期內(nèi)繁殖，真菌的繁殖也很有限，從而實現(xiàn)非無菌操作篩選。其三是篩選劑浸種篩選法，讓轉(zhuǎn)基因種子在低溫處理和萌發(fā)階段在含篩選劑的1/4MS大量元素的液體中進行，剛萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)土中。三種方法與已有的方法相比都有簡單、可靠、高效的特點，解決了擬南芥轉(zhuǎn)化