造血干細(xì)胞和單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞在形態(tài)、表型及功能的對照實驗研究.pdf

1、目的:本實驗旨在探討臍帶血CD34+造血干細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞（CD34-DC）與外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(Mo-DC)在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型、誘導(dǎo)生成的CTL細(xì)胞毒性方面的差異，并探討不同來源的DC超微結(jié)構(gòu)的變化與其抗原處理與抗原提呈功能之間的相關(guān)性，以期制備功能更加強(qiáng)大的DC疫苗。
　　方法:取健康成人外周血，采用密度梯度離心法獲取單核細(xì)胞后誘導(dǎo)生成DC(Mo-DC);取健康足月產(chǎn)孕婦臍帶血，采用磁珠分選法分離純化CD34

2、+造血干細(xì)胞，并培養(yǎng)于含粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子(GM-C SF)/干細(xì)胞因子(SCF)的培養(yǎng)基誘導(dǎo)CD34+造血干細(xì)胞擴(kuò)增及DC前體細(xì)胞的生成，GM-CSF/白細(xì)胞介素-4(IL-4)培養(yǎng)基進(jìn)一步誘導(dǎo)前體細(xì)胞向DC細(xì)胞的分化(CD34-DC)。電鏡下觀察CD34-DC及Mo-DC的形態(tài)，比較其細(xì)胞突起數(shù)量、細(xì)胞核大小及內(nèi)體小泡數(shù)量;流式細(xì)胞術(shù)檢測不同培養(yǎng)時間(d1，d3，d5，d7)的CD34-DC及Mo-DC表面分子表達(dá)，并給予FI

3、TC-OVA257-264沖擊，培養(yǎng)24小時后檢測其抗原提呈能力;取培養(yǎng)至d5的CD34-DC及Mo-DC均負(fù)載CEA蛋白并加入腫瘤壞死因子(TNF-α)制備成CEA特異性的CD34-mDC、Mo-mDC（即DC疫苗），分別體外誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)生成，并利用MTS法檢測其各自對CEA高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系Ls174-T的細(xì)胞毒性，以檢測其激活T細(xì)胞的功能。
　　結(jié)果:
　　1、光學(xué)倒置顯微鏡觀察兩種細(xì)胞來源的d0，

4、d3，d7的CD34-DC、Mo-DC及負(fù)抗原后DC疫苗的形態(tài)學(xué)變化。
　　D0時細(xì)胞均為圓形或橢圓形，且在細(xì)胞膜表面有微小突起，d3兩種來源的DC均表現(xiàn)出樹突狀，Mo-DC突起較少且細(xì)長，呈梭形，而CD34-DC突起較多且粗短，d7 Mo-DC突起更加明顯，且筆直，窄并伴以針尖狀尾部，但CD34-DC突起相對較短且部分突起分叉，細(xì)胞膜粗糙不規(guī)整。整體來看，CD34-DC的突起形成比Mo-DC早。經(jīng)過細(xì)胞因子和腫瘤抗原刺激之后的D

5、C，懸浮生長而失去樹突狀外觀，表現(xiàn)為類圓形，細(xì)胞膜清晰且光滑。
　　2、電鏡觀察CD34-DC、Mo-DC超微結(jié)構(gòu)變化
　　分別觀察d3、d5、d7的CD34-DC、Mo-DC樹突狀突起數(shù)量、細(xì)胞核大小及內(nèi)體小泡數(shù)量。CD34-DC的突起數(shù)量在d5上升、d7下降，而Mo-DCs的突起數(shù)量d3-d7是逐漸減少的。CD34-DC細(xì)胞核直徑于d3、d5、d7分別為5.2±0.3、6.54±0.4、7.34±0.3，而Mo-DC為5

6、.1±0.2、5.2±0.4、5.46±0.4，結(jié)果表明，培養(yǎng)7天后，CD34-DC細(xì)胞核比Mo-DC大（P＜0.05）。CD34-DC的胞漿內(nèi)體小泡數(shù)量于d3、d5、d7分別為29.74±3.23、31.73±4.2、38.24±2.5，Mo-DC分別為:26.28±3.2、24.55±3.7、22.68±2.9，結(jié)果表明，培養(yǎng)7天后，CD34-DC的胞漿內(nèi)體小泡數(shù)量比Mo-DC多(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，與抗原提呈能力密切相關(guān)

7、的內(nèi)體小泡數(shù)量在CD34-DC中多于Mo-DC。
　　3、流式細(xì)胞儀檢測不同來源的DC表面分子CD80、CD83、CD86表達(dá)率。
　　Mo-DC表面CD80的表達(dá)率于d1-d7都極低，而CD83、CD86的表達(dá)率呈逐漸升高趨勢，在經(jīng)腫瘤抗原及促成熟細(xì)胞因子刺激生成Mo-mDC后三種分子均可迅速升高。CD34-DC表面CD80、CD83、CD86的表達(dá)率于d1-d7均呈逐漸升高趨勢，經(jīng)腫瘤抗原及細(xì)胞因子刺激生成CD34-mD

8、C后表達(dá)率亦可迅速升高。Mo-mDC與CD34-mDC相比，三種表面分子表達(dá)率均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，P＞0.05，P＞0.05），說明Mo-DC與CD34-DC經(jīng)抗原及細(xì)胞因子刺激生成的Mo-mDC與CD34-mDC均可成熟。
　　4、取培養(yǎng)d1、d3、d5、d7的CD34-DC、Mo-mDC，分別用FITC標(biāo)記的OVA257-264沖擊后，用流式細(xì)胞儀檢測其在不同時間的抗原提呈能力。
　　D1，CD34-DC中陽性

9、細(xì)胞率為15.27％±1.47，Mo-DC只有5.16％±1.00。在d3、d5、d7，兩種DC陽性細(xì)胞率均呈上升趨勢，d7時，CD34-DC的陽性細(xì)胞表達(dá)率達(dá)到81.8％±1.5，而Mo-DC只有57.2％±1.4，CD34-DC較Mo-DC上升更加明顯(P＜0.05)，說明CD34-DC比Mo-DC具有更強(qiáng)的抗原提呈能力。
　　5、MTS法檢測DCs刺激同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖能力。
　　取兩種來源的未成熟DCs按1∶1

10、分別與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)4天，結(jié)果顯示，以無DC刺激的T細(xì)胞作為對照，經(jīng)CD34-DC刺激后T淋巴細(xì)胞增值率為208±39％，Mo-DC增值率為156±48％。兩者無顯著性差異(P＞0.05)。說明CD34-DC與Mo-DC在刺激同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖能力方面無差異。
　　6、負(fù)載CEA生成的CD34-mDC與Mo-mDC疫苗分別激活的CTL對CEA高表達(dá)的Ls174-T腫瘤細(xì)胞的殺傷效率對比。
　　CEA特異性CD34-m

11、DC激活的CTLs(CC-CTLs)在效靶比為10∶1、50∶1、100∶1時對LS174-T的殺傷率分別為63.3±1.52％、80.6±2.51％、90±2.0％。CEA特異性Mo-mDC疫苗誘導(dǎo)激活的CTLs(CM-CTLs)對LS174-T殺傷率分別為35±2.64％、53.6±3.21％、68.6±3.51％。結(jié)果顯示，CC-CTLs及CM-CTLs都可以殺傷CEA高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞Ls174-T，但CC-CTLs比CM-CTL

12、s有更高的殺傷率(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、經(jīng)GM-CSF/SCF培養(yǎng)基可誘導(dǎo)臍帶血CD34+造血干細(xì)胞擴(kuò)增及生成DC前體細(xì)胞，并在培養(yǎng)d8開始貼壁生長，每3天可收獲一批DC前體細(xì)胞，用GM-CSF/IL-4培養(yǎng)基可進(jìn)一步誘導(dǎo)生成CD34-DC，其表型與Mo-DC無差異。
　　2、臍血造血干細(xì)胞來源的CD34-DC具有更強(qiáng)的抗原提呈、促淋巴細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)激活CTL的能力。
　　3、電鏡下樹突狀突起數(shù)量