多被銀蓮花總皂甙誘導(dǎo)人涎腺腺樣囊性癌高肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞凋亡過程中BcL-2和Bax蛋白的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常見的涎腺惡性腫瘤之一。因其浸潤性強(qiáng)和易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而嚴(yán)重危害人類健康，因此探索新的預(yù)防治療方法，提高對涎腺腺樣囊性癌的療效，是廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)問題。
　　多被銀蓮花(Anemone Raddeana Regel)是毛茛科銀蓮花屬植物的根莖。藥理活性研究發(fā)現(xiàn)，多被銀蓮花提取物有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及抗驚厥作用。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2、表明，多被銀蓮花總皂甙能夠抑制人涎腺腺樣囊性癌高肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞(Adenoid cystic carcinoma of high pulmonarymetastatic，ACC-M)的增殖，并能夠誘導(dǎo)其凋亡。目前Bcl-2家族成員Bcl-2及Bax蛋白在多被銀蓮花總皂甙誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡的過程中是否起重要作用，尚未見國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。本研究擬對體外培養(yǎng)的ACC-M細(xì)胞經(jīng)過多被銀蓮花總皂甙處理后，通過Western Blot方法，檢測Bcl

3、-2和Bax不同時(shí)間點(diǎn)的含量，來驗(yàn)證多被銀蓮花總皂甙誘導(dǎo)ACC-M凋亡過程中Bcl-2家族成員Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)及意義，從而為治療腺樣囊性癌植物性化學(xué)新藥的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、材料
　　1.1 ACC-M
　　北京大學(xué)口腔醫(yī)院提供，建立于1995年。
　　1.2多被銀蓮花總皂甙
　　購買于石家莊樂仁堂藥店（產(chǎn)地為黑龍江省），于河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院經(jīng)溶解與溶劑萃取提純得到。<

4、br>　　2、實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1藥液制備
　　多被銀蓮花總皂甙用DMSO溶解制備成20mg/mL儲存液，于-20℃冰箱中保存，使用時(shí)用DMSO濃度小于0.001％的培養(yǎng)液稀釋。
　　2.2細(xì)胞培養(yǎng)
　　將10％胎牛血清和鏈霉素(100ug/mL)、青霉素(100U/mL)放入RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5％C02、濕度飽和的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每24～48小時(shí)傳1代，用0.04％EDTA和0.25％胰蛋白酶(

5、1∶1)混合液消化并傳代。
　　2.3細(xì)胞接種以及藥物處理
　　用消化液將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后制成4.0×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，再將對照組、24h組、48h組、72h組，共四個(gè)培養(yǎng)瓶中分別接種2mL細(xì)胞懸液，存放于培養(yǎng)箱。經(jīng)過24小時(shí)細(xì)胞貼壁后，再進(jìn)行藥物處理。把20mg/mL的多被銀蓮花總皂甙儲存液稀釋成濃度為50ug/mL的溶液，從培養(yǎng)箱中取出貼壁后的細(xì)胞，把培養(yǎng)液丟棄，于24h，48h，72h各組中分別加入多

6、被銀蓮花總皂甙溶液2mL（濃度為50ug/mL），對照組加入二甲基亞砜的RPMI1640培養(yǎng)液2mL（濃度為50ug/mL）。待藥物作用24、48、72小時(shí)后，提取各組細(xì)胞組織蛋白。
　　2.4提取細(xì)胞組織蛋白
　　將每一組細(xì)胞用PBS洗滌兩次，用消化液消化后制成細(xì)胞懸液，移入相應(yīng)EP管中。3000rmp，4℃，15分鐘離心。把上清液吸出，留沉淀，這一次用衡鹽溶液洗滌吹打，800rmp，離心5分鐘，再次把上清液吸出。往各組中

7、分別加入400uL細(xì)胞裂解液，并震蕩均勻，放在冰上裂解約30分鐘。細(xì)胞裂解后離心15分鐘(4℃，13000rmp)，結(jié)束后，提取上清液就是細(xì)胞蛋白，將細(xì)胞蛋白分別裝入相應(yīng)的EP管中，置于-80℃冰箱保存。
　　2.5蛋白的定量
　　本實(shí)驗(yàn)在波長為570nm下使用分光光度法測定測定各樣本吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合樣品的蛋白濃度。
　　2.6采用western blot檢測Bax和Bcl-2的表達(dá)
　　經(jīng)SDS--P

8、AGE（電泳）;轉(zhuǎn)膜;封閉;孵育;洗滌;將β-actin條帶作為作為對照，奧德賽掃描成像系統(tǒng)的進(jìn)行各波段灰度值測定，半定量測定。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對結(jié)果進(jìn)行方差分析。
　　3、統(tǒng)計(jì)分析
　　實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，收集所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　結(jié)果:Western Blot結(jié)果顯示:經(jīng)50ug/mL多被銀蓮花總皂甙處理后，ACC-M細(xì)胞中促凋亡Bax蛋白的表達(dá)量隨著藥物作用時(shí)間延長而增加，經(jīng)灰度值分析Bax蛋

9、白的表達(dá)量與對照組相比:24h組的蛋白表達(dá)量增加了19.6％(P＜0.05)，48h組的蛋白表達(dá)量增加了35.9％(P＜0.05)，72h組的蛋白表達(dá)量增加了57.2％(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，Bcl-2蛋白的表達(dá)量隨藥物作用時(shí)間延長降低，經(jīng)灰度值分析Bcl-2蛋白的表達(dá)量與對照組相比:24h組的蛋白表達(dá)量降低了21.9％（P＜0.05），48h組的蛋白表達(dá)量降低了40.0％（P＜0.05），72h組蛋白表達(dá)量降低了4

10、5.2％(P＜0.05)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，隨著多被銀蓮花總皂甙作用時(shí)間的延長，Bax/Bcl-2的比值逐漸增大，對照組比值為:0.42±0.009、0.43±0.012、0.43±0.010，無顯著性差異(P＞0.05);24小時(shí)組比值為:0.64±0.009;48小時(shí)組比值為:0.97±0.023;72小時(shí)組比值為:1.24±0.042，有顯著差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:多被銀蓮花總皂甙誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡