炎癥條件下色素上皮衍生因子(PEDF)對血管通透性的影響及其機制研究.pdf

1、目的:
　　嚴重燒傷后機體迅速釋放大量的炎癥介質(zhì)，引發(fā)全身炎癥反應，導致血管內(nèi)皮細胞異常活化和屏障功能障礙，血管通透性增高，進而引起低血容量性休克、筋膜間隙綜合征以及多器官功能障礙等一系列并發(fā)癥，嚴重危及患者的生命。目前對炎癥條件下引起血管通透性增高的因子及其作用機制尚未完全清楚。
　　膿毒癥作為大面積燒傷常見的嚴重并發(fā)癥之一，其本質(zhì)為嚴重感染引起的全身炎癥反應綜合征，可以模擬典型的炎癥條件。在前期研究中，我們通過液相芯片質(zhì)

2、譜分析發(fā)現(xiàn)色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)在嚴重燒傷膿毒癥并發(fā)感染性暴發(fā)性紫癜患者的血清中表達顯著增高，但其在炎癥條件下對血管通透性的影響以及作用機制卻尚未研究。
　　之所以關注PEDF，是因為它是目前發(fā)現(xiàn)的最強新生血管抑制劑，它可以抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)引起的血管生成和血管通透性增高

3、。但是，近年來越來越多的文獻提示PEDF也可能是一種內(nèi)源性的血管活性物質(zhì)，它可能破壞血管內(nèi)皮屏障的完整性，這也是目前本領域的研究熱點。本研究旨在明確炎癥條件下血清PEDF的表達變化，并進一步探討PEDF對血管通透性的影響及其相關機制。
　　材料和方法:
　　1.以膿毒癥模擬典型炎癥條件，采集嚴重燒傷膿毒癥患者和三種不同膿毒癥小鼠(分別為嚴重燒傷膿毒癥、盲腸結扎穿刺(cecal ligation and puncture，CL

4、P)膿毒癥和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的膿毒癥）的血清，同時采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和蛋白印跡實驗(Western blotting，WB)的方法檢測血清中PEDF的表達變化。
　　2.制作CLP膿毒癥小鼠模型，尾靜脈注射外源性PEDF和PEDF單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)，觀察小鼠氣管血管

5、和提睪肌血管熒光微球漏出以及小鼠皮膚微血管伊文思藍(Evan's blue，EB)漏出情況，同時檢測小鼠血液中異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的右旋糖酐的熒光強度。
　　3.培養(yǎng)人皮膚微血管內(nèi)皮細胞(human dermal microvascular endothelial cells，HDMECs)，檢測細胞在不同濃度PEDF作用不同時間的條件下，跨細胞電阻(Transend

6、othelial electrical resistance, TER)的變化。
　　4.培養(yǎng)HDMECs，隨機分為正常對照組、PEDF處理組、LPS處理組、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)處理組、PEDF+LPS聯(lián)合處理組和PEDF+TNF-α聯(lián)合處理組，檢測Transwell中FITC標記的右旋糖酐漏出情況和RhoA激活情況，同時細胞免疫熒光染色觀察應力纖維F-actin和緊密連接

7、閉鎖小帶(Zonula occludens-1，ZO-1)的形態(tài)變化。
　　5.外源性加入RhoA特異性抑制劑C3轉移酶，檢測細胞Transwell熒光漏出情況和RhoA激活情況，同時細胞免疫熒光染色觀察應力纖維F-actin和緊密連接蛋白ZO-1的形態(tài)變化。
　　6.提取細胞膜蛋白和組織總蛋白，檢測PEDF的受體脂肪甘油三酯酯酶(Adiposetriglyceride lipase，ATGL)和層粘連蛋白受體（lamini

8、n receptor，LR）在炎癥條件下的表達變化，并采用免疫共沉淀(immunoprecipitation，IP)的方法檢測PEDF與其受體間的相互作用。
　　7.構建PEDF受體的慢病毒干擾載體，分別干擾ATGL和LR，檢測Transwell熒光漏出情況和RhoA激活情況，同時細胞免疫熒光染色觀察緊密連接蛋白ZO-1的形態(tài)變化。
　　結果:
　　1.以膿毒癥模擬典型炎癥條件，我們發(fā)現(xiàn)在嚴重燒傷膿毒癥患者中，血清PE

9、DF的表達是顯著增高的。在三種膿毒癥小鼠中，血清PEDF的表達整體呈增高趨勢。具體而言，嚴重燒傷膿毒癥小鼠血清PEDF水平從傷后6h開始增高，至12h達到峰值，隨后開始下降;CLP膿毒癥小鼠血清PEDF水平從傷后3h開始增高，至12h達到峰值，隨后開始下降;而LPS膿毒癥小鼠血清PEDF水平在傷后3h達到峰值，隨后出現(xiàn)波動變化。
　　2.在正常小鼠中，大劑量PEDF單獨作用能夠引起血管通透性的增高，表現(xiàn)為熒光微球和EB漏出增多，血

10、液熒光強度降低。在膿毒癥小鼠中，血管通透性明顯高于正常小鼠，注入外源性PEDF能夠使得已經(jīng)增高的血管通透性進一步增高，而注入PEDF-mAb則能抑制炎癥條件下血管通透性的增高。
　　3.PEDF對血管內(nèi)皮細胞通透性的影響呈現(xiàn)劑量和時間的依賴關系。
　　4.在LPS和TNF-α炎癥介質(zhì)處理條件下，內(nèi)皮細胞旁通透性增高，而外源性PEDF能夠使得已經(jīng)增高的細胞旁通透性進一步增高，表現(xiàn)為Transwell中FITC標記的右旋糖酐大量

11、漏出。PEDF增高內(nèi)皮細胞旁通透性主要是通過引起應力纖維F-actin的重排和緊密連接蛋白ZO-1的分解。
　　5.大劑量PEDF單獨作用能夠引起RhoA的激活、應力纖維F-actin的重排和緊密連接蛋白ZO-1的分解。在炎癥條件下，PEDF的這種效應更加明顯，而RhoA的特異性抑制劑C3轉移酶能夠抑制PEDF增高血管通透性這一效應。
　　6.在炎癥條件下，細胞膜表面和小鼠內(nèi)臟組織的ATGL受體表達增加，并且與PEDF的相互

12、作用增強，而LR受體無明顯變化。
　　7.在ATGL穩(wěn)定缺失的內(nèi)皮細胞中，外源性PEDF不能夠引起RhoA的激活、細胞旁通透性的增高和緊密連接蛋白ZO-1的分解。而在LR穩(wěn)定缺失的內(nèi)皮細胞中，外源性PEDF仍然能夠引起RhoA的激活、細胞旁通透性的增高和緊密連接蛋白ZO-1的分解。
　　結論:
　　炎癥條件下血清PEDF的表達顯著增高，與此同時，血管內(nèi)皮細胞表面的PEDF受體ATGL的表達也顯著增多，PEDF與ATGL