手術(shù)創(chuàng)傷后外周循環(huán)炎癥因子對(duì)不同年齡小鼠血腦屏障通透性的影響.pdf

1、血腦屏障(Blood Brain Barrier, BBB)是存在于腦組織與血液之間復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)，能阻擋病原體和有害物質(zhì)由血液進(jìn)入腦室和腦組織，是機(jī)體天然免疫的重要屏障之一。BBB主要由腦部的微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Brain MicrovascularEndothelial Cells，BMEC)、周皮細(xì)胞(Pericyte)、基膜(Basement Membrance，BM)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte)和部分神經(jīng)元軸突末梢構(gòu)成。任

2、何組成成分的破壞都將導(dǎo)致BBB通透性的變化，繼而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nerves System,CNS)的健康和功能。因此BBB已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域熱點(diǎn)之一，特別是BBB通透性調(diào)控方面的研究對(duì)于人類深入認(rèn)識(shí)腦類疾病的致病機(jī)制及其治療具有重大意義。目前國內(nèi)外對(duì)病理因素導(dǎo)致BBB通透性變化的研究都集中于大腦內(nèi)部的損傷或創(chuàng)傷，如創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic Brain Injury, TBI），中風(fēng)（Stroke），缺血(

3、Ischemia)等。而外周創(chuàng)傷，如手術(shù)，燒創(chuàng)傷等對(duì)BBB通透性影響的原因和機(jī)制并不明確。以往研究多認(rèn)為，外周創(chuàng)傷后的應(yīng)激反應(yīng)造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥，進(jìn)而破壞BBB的完整性。
　　Mervyn等2010年發(fā)表在PNAS上的研究證明術(shù)前給予小鼠外周循環(huán)注射TNF-α中和抗體可以保護(hù)BBB的完整性。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，不同年齡組小鼠（9個(gè)月和18個(gè)月）在經(jīng)歷外周手術(shù)（腹部手術(shù)）后，血腦屏障通透性隨年齡的增長(zhǎng)有增加的趨勢(shì)，且行為學(xué)發(fā)生

4、了改變，老年組（18個(gè)月）的變化更為明顯。以上研究均表明，外周循環(huán)炎癥對(duì)手術(shù)創(chuàng)傷后BBB通透性存在著影響。因此，尋找出外周創(chuàng)傷導(dǎo)致BBB通透性增高的機(jī)制是預(yù)防臨床術(shù)后認(rèn)知障礙（Postoperate Cognitive Dysfunction，POCD）的關(guān)鍵?；诖?，本研究分為以下三部分:1.對(duì)本研究采用的小鼠手術(shù)模型中可造成血腦屏障通透性增高的因素（麻醉和外周循環(huán)中的炎癥因子）以及適當(dāng)檢測(cè)方法（BBB通透性變化的時(shí)間點(diǎn)和示蹤劑的選擇

5、）進(jìn)行篩選;2.用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)由手術(shù)引起的外周循環(huán)中和大腦實(shí)質(zhì)組織炎癥因子（IL-6）的濃度，使用分子量為10KDa的示蹤劑(10 KDa Tracer) Dextran10，用免疫熒光的方法在熒光顯微鏡下觀察不同年齡組BBB通透性的變化，并對(duì)BBB漏出程度予以定量，使用Western Blotting方法檢測(cè)BBB完整性關(guān)鍵蛋白（緊密連接，Tigh

6、t Junction，TJ）的變化，使用Y迷宮(Y Maze)等行為學(xué)檢測(cè)方法觀察小鼠行為學(xué)的改變;3.使用白介素-6中和抗體（Anti-IL-6 NeutralizingAntibody）以及使用白介素-6基因敲除小鼠（IL-6 Gene Knockout mice）來驗(yàn)證關(guān)鍵炎癥因子導(dǎo)致BBB通透性增高的理論。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:1.本研究小鼠在全麻狀態(tài)下行腹部手術(shù)的模型中，外周炎癥因子IL-6在手術(shù)后6小時(shí)左右達(dá)到高峰，且老

7、年組（18個(gè)月）比普通成年組(9個(gè)月)上升幅度更大，而僅給予麻醉組小鼠在24小時(shí)內(nèi)血清IL-6水平以及BBB的通透性沒有明顯變化;在示蹤劑的選擇上，僅觀察到分子量較小的10KDa的Dextran于在術(shù)后6小時(shí)左右由腦血管漏出，而分子量較大的70KDa Dextran和伊文氏藍(lán)(Evans Blue，EB)沒有漏出;2.對(duì)Dextran10的定量實(shí)驗(yàn)中，成年手術(shù)組漏出量約為對(duì)照組的1.3倍，而老年手術(shù)組為1.6倍左右;行為學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)術(shù)后成