“痰瘀同治”方藥調(diào)控肥大細胞功能改善動脈粥樣硬化斑塊的機制研究.pdf

1、研究背景:動脈粥樣硬化(AS)導致的心腦血管疾病是當今人類死亡的首位原因，其重要的特征之一就是病灶處各類炎癥、免疫細胞的聚集浸潤。肥大細胞作為機體分泌最活躍的細胞之一，主要通過脫顆粒、釋放顆粒內(nèi)容物產(chǎn)生多種活性介質(zhì)等發(fā)揮作用。有病理研究發(fā)現(xiàn)因心肌梗塞死亡的病人冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂處的血管外膜周邊存在著大量的肥大細胞，且大多呈被激活脫顆粒后狀態(tài)，這表明肥大細胞與斑塊的發(fā)展進程密切相關(guān)。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學中醫(yī)對于AS發(fā)生機制的解釋歸結(jié)為“痰瘀

2、互結(jié)證”。AS初期病變脂質(zhì)條紋、內(nèi)膜下泡沫細胞集聚即為痰濁阻滯、痰凝不散之具體體現(xiàn);AS后期斑塊破裂，血小板激活以及高凝血狀態(tài)、血栓形成視為血瘀證范疇。我院吳宗貴教授主持研制的“痰瘀同治”方藥(Eliminating Sputum andRemoving Stasis Formulation)在前期研究中已經(jīng)證明具有改善新西蘭兔高脂血癥、調(diào)控小鼠T細胞免疫等作用。本試驗目的是借助ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊模型，探究“痰瘀同治”方

3、藥如何通過調(diào)節(jié)肥大細胞功能改善斑塊的機制。
　　研究方法:
　　1、ApoE-/-小鼠AS斑塊模型的建立與評估:選用6-8周齡雄性ApoE-/-小鼠為研究對象。(1)建模:首先行小鼠左頸動脈分支限流術(shù)，造成局部血液渦流狀態(tài);一周后行左腎動脈狹窄術(shù)，引發(fā)腎血管性高血壓。術(shù)前和手術(shù)期間給予普通飲食喂養(yǎng)，左腎動脈狹窄術(shù)后第2天開始給予高脂飼料喂養(yǎng)直至第12周實驗終點。(2)模型效果評估:建模第4周對小鼠進行頸動脈插管測量動脈收縮壓

4、及小動物血流多普勒超聲檢測頸動脈血流峰速情況，試驗終點比較頸動脈斑塊負荷程度三個方面來評估小鼠AS斑塊模型制備情況。
　　2、“痰瘀同治”方藥調(diào)控肥大細胞功能改善動脈粥樣硬化斑塊的機制研究:將小鼠隨機分為空白對照組(CON)、單純模型組(MOD)、阿托伐他汀組(ATO)、“痰瘀同治”方藥組（ERF），每組10只。飼以高脂飼料喂養(yǎng)同時灌胃給藥，12周實驗終點采用主動脈內(nèi)膜大體油紅o染色比較斑塊面積;主動脈根部冰凍切片油紅染色比較斑塊

5、內(nèi)脂質(zhì)負荷面積;膽固醇及甘油三酯液體單試劑檢測盒（酶法）檢測總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)水平;快速蛋白液相色譜法(FPLC)檢測小鼠血漿脂蛋白含量;比色法測定血清類胰蛋白酶活性;主動脈根部冰凍切片甲苯胺藍染色比較血管外膜周邊肥大細胞聚集脫顆粒情況;熒光實時定量PCR(PolymeraseChain Reaction)和免疫印跡實驗(Westem blot)測定肥大細胞相關(guān)蛋白和血漿炎癥因子表達情況。
　　研究結(jié)果:

6、　　1、ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊模型的測評
　　(1)小鼠頸動脈插管測量動脈收縮壓:ApoE-/-小鼠采用頸動脈插管法檢測動脈收縮壓，測得對照小鼠收縮壓平均為108.9±9.8mmHg，其余模型小鼠收縮壓平均為154.5±9.1 mmHg，模型小鼠之間收縮壓差異無統(tǒng)計學意義。
　　(2)小鼠頸動脈多普勒超聲測量血流峰值:同對照組（627.52±44.82 mm/s）相比較，結(jié)扎后4周（205.72±36.84 mm

7、/s）模型小鼠左頸動脈血液流速收縮期峰值(peak systolic velocity，Vmax)明顯下降。模型小鼠之間頸動脈血液流速收縮期峰值差異無統(tǒng)計學意義。
　　(3)小鼠頸動脈冰凍切片蘇木精依紅染色(HE)及油紅o染色:較對照組(539.32±58.92×103um2)，模型組小鼠（790.59±92.12×103um2）頸動脈切片斑塊負荷面積明顯增加。以上結(jié)果提示，局部頸動脈低切應力(LSS)及腎血管性高血壓誘導可加速小

8、鼠動脈粥樣硬化的形成及發(fā)展。
　　2、“痰瘀同治”方藥調(diào)控肥大細胞功能改善動脈粥樣硬化斑塊的機制研究:“痰瘀同治”方組較阿托伐他汀組降低小鼠血漿TC水平效果更為明顯，其血漿TG、血漿低密度脂蛋白（LDL）、血清類胰蛋白酶含量較模型組亦顯著下降。主動脈血管組織肥大細胞相關(guān)蛋白:白三烯C4合成酶(LTC4S)、組氨酸脫羧酶(HDC)、類糜蛋白酶1(CMA1)、類胰蛋白酶6（MCT6）與血漿腫瘤壞死因子（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子β1(

9、TGF-β1)在阿托伐他汀組和“痰瘀同治”方組之間存在顯著差異。主動脈內(nèi)膜大體油紅o染色和主動脈根部冰凍切片油紅o及甲苯胺藍染色顯示模型可加速動脈硬化粥樣斑塊形成，促使肥大細胞在動脈血管外膜聚集脫顆粒，“痰瘀同治”方藥可減少動脈血管內(nèi)斑塊負荷面積，降低斑塊內(nèi)脂質(zhì)負荷水平，削弱肥大細胞在動脈外膜處的聚集和脫顆粒程度，從而達到改善動脈粥樣硬化斑塊的作用。
　　研究結(jié)論:
　　1、ApoE-/-小鼠頸動脈分支限流合并腎動脈狹窄手術(shù)