檢測18種（型-亞型）呼吸道病毒的兩種反應(yīng)實(shí)時熒光定量PCR的建立及其在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用.pdf

1、本研究分為三部分:
　　一、檢測18種（型/亞型）呼吸道病毒的兩種反應(yīng)實(shí)時熒光定量PCR的建立
　　臨床常見的呼吸道病毒種類眾多，感染的臨床表現(xiàn)相似，根據(jù)臨床癥狀難以進(jìn)行病原學(xué)鑒別診斷。根據(jù)文獻(xiàn)報道的引物和探針，成功建立了2種不同反應(yīng)條件實(shí)時熒光定量PCR方法檢測18種（型/亞型）呼吸道病毒。通過驗(yàn)證該法的敏感性和特異性、準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示，該法的最低檢測限為10拷貝數(shù)/μL，變異系數(shù)(CV)為1.27％～3.44％，且特異性

2、良好。經(jīng)檢測408份呼吸道標(biāo)本，鼻拭子檢測的陽性率為63.2％(225/356)，肺泡灌洗液檢測的陽性率為25％(13/52)。說明建立的real-time PCR法簡便、特異、靈敏、穩(wěn)定。
　　二、2011-2014年廣州市4種常見冠狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查及2013-2014年不明原因肺炎患者中新型冠狀病毒的調(diào)查
　　通過上述的Real-time PCR方法檢測18種（型/亞型）呼吸道病毒，分析2011-2014年廣州市發(fā)熱

3、呼吸道癥候群患者中229E、OC43、NL63、HKU1的流行病學(xué)情況。結(jié)果表明，4種冠狀病毒的總檢出率為4.42％(104/2355)，HCoV合并HRV(17.3％，18/104)及HCoV合并RSV(14.4％，15/104)感染最常見;不同年齡組(P=0.188＞0.05)、不同來源標(biāo)本(P=1.000＞0.05)中4種常見人類冠狀病毒的檢出率無明顯差異。2011年11月-2014年12月HCoVs流行情況大致為HCoVs各季節(jié)

4、均有分布;其中OC43和NL63主要分布于2012年和2014年，呈兩年一次高峰期的典型特征，OC43各季節(jié)均有分布，但NL63主要集中于夏秋季(6-10月);229E與HKU1呈散在分布。HCoV感染患者最常見的臨床癥狀為發(fā)熱。大部分(66.3％)患者出現(xiàn)了下呼吸道感染，甚至出現(xiàn)重癥肺炎(6.73％)及死亡病例(1.92％)，說明HCoV感染不僅引起輕型呼吸道癥狀，還會引發(fā)嚴(yán)重疾病。
　　此外，我們還通過通用型巢式PCR及基因測

5、序，對2013-2014年不明原因肺炎患者中新型冠狀病毒進(jìn)行調(diào)查，以篩查出新型冠狀病毒。結(jié)果顯示，不明原因肺炎患者272份呼吸道標(biāo)本（鼻拭子標(biāo)本數(shù)n=204，肺泡灌洗液n=68）中，均無檢測出新型冠狀病毒。然而，由于重癥肺炎及死亡病例在不明原因肺炎中分別占9.93％(27/272)和3.68％(10/272)，提示UP可引發(fā)嚴(yán)重疾病。
　　三、10年前后SARS患者核衣殼蛋白抗體效價變化的血清學(xué)研究
　　以實(shí)驗(yàn)室前期Bac-

6、to-Bac桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的重組SARS-NP作為抗原，進(jìn)一步優(yōu)化建立間接ELISA法，檢測10年前后SARS患者恢復(fù)期血清中SARS-NP特異性IgG，分析SARS-NP IgG水平變化情況。實(shí)驗(yàn)表明，基于桿狀病毒表達(dá)的間接ELISA法與其它病原體無交叉反應(yīng)。532份體檢者血清中，間接ELISA檢出率為1.13％(6/532)，經(jīng)Western blot確證陽性率為0.75％(4/532)。該法的假陽性率為0.38％，特異性為99.

7、62％。同時測定了13名SARS患者10年前后的血清，總檢出率為95％（57/60，n=60，n表示13名SARS患者10年前、后的總血清標(biāo)本數(shù)），即敏感度為95％;10年前的血清檢出率為98.2％（54/55，n=55，n表示13名SARS患者10年前的血清標(biāo)本數(shù)）;10年后的血清（n=5，n表示上述其中5名SARS患者10年后的血清標(biāo)本數(shù)）中，僅3份檢測為陽性。此外，5名SARS患者10年前SARS-NP IgG最高效價由1∶160

8、到1∶5120不等，10年后SARS-NP IgG最高效價由1∶10-1∶160不等。10年前后SARS患者體內(nèi)SARS-NP IgG水平呈明顯的下降趨勢，但部分患者SARS-NP IgG抗體效價仍很高，說明SARS-NP IgG可長期存在于患者體內(nèi)。
　　小結(jié)：
　　綜上所述，本研究的必要性及意義如下:
　　1.本研究成功建立了檢測18種（型/亞型）呼吸道病毒的兩種反應(yīng)的real-time PCR并進(jìn)行了臨床標(biāo)本評估

9、。本方法簡便，涵蓋的病毒種類多，成本低，且具有臨床應(yīng)用價值，并為發(fā)熱呼吸道癥候群監(jiān)測平臺的建立及其在流行病學(xué)中的應(yīng)用提供了有力的技術(shù)支持。
　　2.分析發(fā)熱呼吸道癥候群患者中229E、OC43、NL63、HKU1的流行病學(xué)特征及臨床特征，對不明原因肺炎患者中新型冠狀病毒及臨床特征進(jìn)行調(diào)查，實(shí)時監(jiān)測呼吸道病原體的構(gòu)成及流行特征，對預(yù)防預(yù)警重大傳染病及新發(fā)傳染病的發(fā)生發(fā)展有重要的意義。
　　3.建立基于桿狀病毒表達(dá)重組SARS-