非肌肉肌球蛋白NMⅡA通過JNK信號途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞的遷移與侵染.pdf

1、胃癌（gastric cancer）是中國最常見的消化道惡性腫瘤之一。胃癌的發(fā)病率在亞洲國家包括中國在內(nèi)仍然居高不下；然而胃癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈下降趨勢。我國是胃癌發(fā)病大國，因此針對胃癌的研究顯得尤為重要。由于胃癌早期多無癥狀或缺乏典型的臨床表現(xiàn)，診斷率不足，多數(shù)患者就診時已進(jìn)入胃癌進(jìn)展期，胃癌一旦進(jìn)入晚期或轉(zhuǎn)移性階段,傳統(tǒng)的治療效果不理想，預(yù)后較差。對晚期胃癌患者使用手術(shù)治療，和術(shù)后的化療，對提高患者的生存率沒有明顯的作用。晚期胃

2、癌患者手術(shù)后5年的生存率并沒有明顯的提高，死亡率仍保持在較高水平。目前常用的放化療和手術(shù)治療等癌癥治療方法，可能會導(dǎo)致機(jī)體免疫力的降低。臨床上通過 TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤組織學(xué)類型，對患者進(jìn)行術(shù)前評估和預(yù)后判斷，效果也不是很理想。因此尋找新的胃癌治療方法迫在眉睫。近些年來,隨著分子生物學(xué)與免疫學(xué)的迅速發(fā)展,研究方法的不斷進(jìn)步尋找新的胃癌轉(zhuǎn)移和侵襲過程中的相關(guān)基因，闡明其可能的作用機(jī)制。因此，尋找新的分子對胃癌的研究具有重要意義。<

3、br>　　非肌肉肌球蛋白NMⅡA特異的存在于血小板、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn) NMⅡA在細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及機(jī)體的免疫應(yīng)答等生理過程中起著重要的作用。
　　在本研究中，我們首先觀察了NMⅡA在胃癌病理組織中和5種胃癌細(xì)胞系的表達(dá)情況，分析了NMⅡA的表達(dá)水平與胃黏膜癌變不同階段的表達(dá)，以及臨床病理學(xué)特征的關(guān)系；本研究同時觀察了NMⅡA對胃癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移和侵襲的影響；研究了NMⅡA抑制胃癌細(xì)胞

4、遷移和侵襲相關(guān)的信號通路。進(jìn)一步的明確NMⅡA在胃癌胃癌遷移和侵襲的作用途徑，是今后研究胃癌的一個新的作用靶點(diǎn)。本研究分為以下三個部分:
　　第一部分、NMⅡA在胃癌組織中的表達(dá)和臨床意義
　　方法：
　　1.收集2008到2014年之間在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受胃癌手術(shù)切除治療的胃癌組織標(biāo)本和及相應(yīng)配對癌旁組織標(biāo)本，共計(jì)選取病例163例，檢測NMⅡA在胃癌患者中組織標(biāo)本和及相應(yīng)配對癌旁組織標(biāo)本的表達(dá)。
　　2.

5、利用Real-time PCR和Western blot從基因水平和蛋白水平驗(yàn)證4例胃癌組織標(biāo)本和及相應(yīng)配對癌旁組織標(biāo)本的NMⅡA的表達(dá)情況。
　　3.收集和利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析胃癌患者臨床病理資料，研究其與NMⅡA表達(dá)水平的相關(guān)性；
　　4.統(tǒng)計(jì)分析NMⅡA表達(dá)在胃黏膜癌變不同階段的表達(dá)
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化染色結(jié)果顯示，NMⅡA在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)的癌旁組織（P<0.001）。利用顯微鏡觀察，

6、在胃癌組織中，NMⅡA的表達(dá)水平很高，且主要分布于細(xì)胞漿及細(xì)胞膜中；而在其相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本中， NMⅡA的表達(dá)量不高，且主要分布于細(xì)胞核中。NMⅡA在163例胃癌組織中有145例表達(dá)呈陽性，表達(dá)陽性率為89.0％，而在163例癌旁組織中僅有51例表達(dá)呈陽性，表達(dá)陽性率為30.1%。以上結(jié)果說明和癌旁組織相比，NMⅡA的表達(dá)水平明顯升高，具有顯著性差異（P<0.001）。在4例新鮮胃癌組織及對應(yīng)的癌旁組織中，利用Realtime PCR

7、和Western blot進(jìn)一步檢測NMⅡA的表達(dá)情況，結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，4例胃癌組織中NMⅡA的表達(dá)明顯高于相應(yīng)癌旁組織。
　　2.NMⅡA的表達(dá)水平與胃癌的浸潤深度、胃癌TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，NMⅡA的表達(dá)水平與胃癌的浸潤深度，尤其是在全層（P<0.001）、TNM分期，尤其是III期和IV期（P<0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，尤其是N1+階段（P<0.001）密切相關(guān)。NMⅡA在高深度浸潤、高T

8、NM分期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌病例中的表達(dá)水平越高。
　　3.NMⅡA的表達(dá)與胃癌分化程度及幽門螺桿菌感染亦無明顯相關(guān)，在腸型胃癌和彌漫型胃癌中表達(dá)無顯著差異。
　　第二部分、NMⅡA對胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響
　　方法：
　　1.選取5種胃癌細(xì)胞系和1種非癌細(xì)胞GES-1細(xì)胞（永生化胃黏膜上皮細(xì)胞）作為對照，利用Western blot檢測NMⅡA在上述細(xì)胞的的表達(dá)水平；最終根據(jù)其表達(dá)水平，選取胃癌細(xì)胞系SG

9、C-7901和MGC-803作為后續(xù)研究的細(xì)胞模型。
　　2.利用RNAi干擾技術(shù)，轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，并利用Real-time PCR和Western blot分別驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的有效性。
　　3.利用MTT實(shí)驗(yàn)觀察改變NMⅡA的表達(dá)對SGC-7901和MGC-803細(xì)胞體外增殖能力的影響。
　　4.利用細(xì)胞劃痕和Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)研究在SGC-7901和MGC-803細(xì)胞中，NMⅡA對胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲的影響。

10、
　　結(jié)果：
　　1.NMⅡA在胃癌細(xì)胞系 SGC7901、AGS、BGC823、MKN28和MGC803中的表達(dá)水平明顯高于對照組的 GES-1細(xì)胞；NMⅡA在SGC7901和MGC803的表達(dá)量較高。
　　2.MTT結(jié)果顯示，下調(diào)NMⅡA的表達(dá)可降低SGC7901和MGC803細(xì)胞的體外增殖能力。
　　3.劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)NMⅡA的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

11、r>　　第三部分、降低NMⅡA的表達(dá)對胃癌細(xì)胞中JNK/c-Jun信號通路的影響
　　方法：
　　1.利用 Western blot檢測NMⅡA在胃癌細(xì)胞中JNK/c-Jun信號通路的影響。
　　2.加入茴香霉素，檢測JNK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　3.使用RNAi干擾在NMⅡA低表達(dá)的胃癌細(xì)胞中，利用劃痕和Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究茴香霉素對胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲的影響。
　　結(jié)果

12、：
　　1.干擾NMⅡA的表達(dá)可明顯降低低胃癌細(xì)胞SGC7901中JNK和c-Jun磷酸化的表達(dá)水平。
　　2.在NMⅡA低表達(dá)的胃癌細(xì)胞中，茴香霉素可以增強(qiáng)JNK和c-Jun的磷酸化水平。
　　3.在NMⅡA低表達(dá)的胃癌細(xì)胞中，劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，茴香霉素可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　結(jié)論：
　　1.NMⅡA在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中高表達(dá)；NMⅡA在高深度浸潤、高TN