CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞分泌的IL-10、IL-35在過敏性哮喘中作用機制的初步研究.pdf

1、背景和目的:
　　哮喘是一種由多種因素引起的氣道炎癥性疾病，隨著免疫學和分子生物學的飛速發(fā)展，過敏性哮喘的發(fā)病機制研究也取得了很大進展。據(jù)研究顯示有多種免疫細胞、免疫分子等介質(zhì)參與哮喘疾病的調(diào)節(jié)，這主要是因為哮喘患者氣道處于高反應性狀態(tài)，而且這種狀態(tài)持續(xù)發(fā)生。早期人們傳統(tǒng)認為 Th1/Th2失衡和IgE介導的變應原性致敏是導致哮喘的根本原因。大量醫(yī)務科研工作者從免疫學角度對哮喘的機制進行深入研究，發(fā)現(xiàn)Treg細胞分泌的IL-10、

2、IL-35與哮喘的發(fā)生有關(guān)，但具體的作用機制尚不完全清楚。
　　CD4+CD25+Treg是最新發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細胞，是機體免疫調(diào)節(jié)中不可缺少的角色，主要靠分泌相關(guān)抑制性細胞因子發(fā)揮免疫抑制功能。Treg(CD4＋CD25＋T)與Teff（CD4＋CD25-T)細胞在可溶性抗CD3抗體、抗CD28抗體聯(lián)合作用下并相互親密接觸，才能使Treg細胞分泌相關(guān)抑制性因子。研究顯示，Treg細胞發(fā)揮免疫抑制功能的細胞因子主要

3、有IL-10、IL-35和TGF-β。Treg細胞分泌的IL-10是免疫抑制功能的重要成分，是與Treg密切相關(guān)發(fā)揮免疫抑制作用的細胞因子，但不是唯一的抑制性細胞因子。IL-35是近年來發(fā)現(xiàn)的介導Treg細胞免疫抑制功能的重要因子，它是IL-12家族的成員，由EBI3/IL-27β和IL12α/p35異源二聚體組成。它可以直接作用于效應T細胞發(fā)揮作用，能誘導初始 T細胞產(chǎn)生新型的調(diào)節(jié)性 T細胞-T35細胞（ iTR35)。有研究顯示，T

4、reg和Teff在體外共同培養(yǎng)后，能上調(diào)EBI3和IL12αmRNA的表達量。這表明Teff和Treg共同培養(yǎng)下可能增強IL-35的分泌，猜測Teff與Treg混合培養(yǎng)可能增強Treg的免疫調(diào)節(jié)功能。TGF-β也是介導Treg細胞非常重要的免疫抑制性因子。這些免疫抑制性因子也可能是在過敏性哮喘中發(fā)揮免疫負調(diào)節(jié)作用的重要介質(zhì)。
　　方法：
　　1.將SPF級雌性BALB/c小鼠隨機分為模型組和對照組，分別用OVA和生理鹽水致敏

5、和激發(fā)，建立哮喘模型和對照模型。
　　2.解剖小鼠取出脾臟并充分研磨，用淋巴細胞分離液分離單個核細胞。利用MACS(Magnetic Activated Cell Sorting)技術(shù)將脾臟單個核細胞分為Treg和Teff。3.用流式細胞儀檢測分析所得的Treg和Teff的純度。
　　4. anti-CD3e包被96孔細胞培養(yǎng)板，添加磁珠分選Treg和Teff細胞并加入
　　anti-CD28，在不同條件下，對Treg

6、和Teff進行單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，每種培養(yǎng)方式重復三個孔。
　　5.在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，收集上清用ELISA試劑盒檢測不同培養(yǎng)方式下IL-10、IL-35的蛋白表達量。收集不同培養(yǎng)方式下所得細胞，提取細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA為模板，用熒光定量PCR檢測IL-10、EBI3和p35基因的mRNA表達情況。
　　6.應用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析；利用GraphPad Pris

7、m5制作統(tǒng)計圖。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立小鼠哮喘模型和對照模型。
　　2.成功提取各個小鼠的單個核細胞并利用 MACS技術(shù)成功分選出 Treg(CD4＋CD25＋T)與 Teff（CD4＋CD25-T)細胞，分選出的 Treg和 Teff原代細胞純度達80％左右。
　　3.與對照組相比，六種培養(yǎng)方式IL-10、EBI3和P35的基因的相對表達量都有所下降，但無顯著性差異（0.5＜2-ΔΔCt＜2）。Treg

8、+Teff組和Treg+Teff+αCD3/CD28組的 IL-10、EBI3和 P35的基因表達量比其它四組明顯下降，其中Treg+Teff+αCD3/CD28組的IL-10下降顯著(2-ΔΔCt＜0.5）。
　　4.與對照組相比，不同培養(yǎng)方式的IL-10和IL-35的蛋白相對表達量都有下降，但無顯著性差異（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　Treg細胞分泌的 IL-10和 IL-35可能和過敏性哮喘有著密切的關(guān)系，