肺組織定居記憶T細胞在過敏性哮喘中的作用.pdf

1、目的：組織定居記憶T細胞（Tissue-residentmemoryTcells,TRM）是記憶T細胞的新亞群，初始T細胞在抗原激活后會遷移到多種外周非淋巴組織器官，在原位分化成特異性的記憶T細胞，而定居下來，不再經(jīng)過淋巴細胞再循環(huán)，當在該組織中遇到相同抗原時能迅速發(fā)生應答，在保護性免疫作用中獨立于循環(huán)記憶T細胞。目前在皮膚、肺、陰道粘膜、大腦，甚至在淋巴組織中都已發(fā)現(xiàn)了TRM的存在，其中CD8+TRM細胞的表型為：CD69+CD103

2、+，CD4+TRM細胞的表型為：CD69+CD11a+。
　　過敏性哮喘是一種常見的、復雜的、多基因調(diào)控的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是慢性的氣道炎癥以及非特異性的氣道高反應。過敏性哮喘的炎癥應答由多種炎癥細胞（如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和氣道上皮細胞等）和炎癥因子共同參與，其臨床表現(xiàn)為反復發(fā)作的喘息、氣急、胸悶、咳嗽等癥狀。目前，全世界將近3億人口患有過敏性哮喘，中國就有約3000萬患者，且其發(fā)病率仍

3、然在以每十年近50％的速度增加，嚴重危害人們的健康。
　　過敏性哮喘屬于再次免疫應答的范疇，過敏原誘導免疫應答并形成特異性的TRM細胞，在肺中長期存在；當過敏原再次進入呼吸道后迅速激活肺TRM細胞，TRM細胞可能在過敏性哮喘的發(fā)病機制中扮演重要角色。本實驗利用過敏性哮喘的小鼠模型，研究了肺TRM細胞在過敏性哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：
　　1、建立過敏性哮喘小鼠模型
　　1.1小鼠的致敏和激發(fā)
　　取

4、雌性6周齡BALB/c小鼠，隨機分為以下2組：正常對照組，哮喘模型組。哮喘模型組：每只小鼠分別于實驗開始0天和14天腹腔注射0.02%OVA致敏液200μl。于實驗開始第35天(第二次致敏三周后)，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50mg/kg），每只約100-120μl，待麻醉后，鼻腔吸入0.4%OVA激發(fā)液50μl，連續(xù)5天。正常對照組：用PBS緩沖液代替致敏液和激發(fā)液，方法同模型組。
　　1.2血清IgE檢測：分別于末次致敏后三周和

5、末次激發(fā)后24小時摘眼球取血，分離血清，用ELISA檢測OVA特異性抗體IgE水平。
　　1.3氣道高反應性檢測肺氣道阻力和動態(tài)肺順應性。
　　1.4處死小鼠，取肺組織做病理切片，HE染色，觀察炎癥浸潤情況；PAS染色，觀察氣道粘液分泌情況；
　　1.5收集支氣管肺泡灌洗液和肺勻漿液：ELISA檢測上清中細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-1β、MCP-1、MIP-1α的含量；
　　1.6取支氣管肺泡

6、灌洗液中的細胞，瑞氏-吉姆薩染色分類計數(shù)炎性細胞；
　　1.7實時定量PCR檢測肺組織中IL-5、IL-10、IL-13、IFN-γ、IL-1β、MCP-1、MIP-1α、RANTES、Eotaxin、GRO-α的mRNA表達。
　　2、分析致敏小鼠肺TRM細胞
　　分組和致敏方案同1.1，小鼠末次致敏三周后，處死小鼠，流式細胞儀分別檢測其肺和脾記憶T細胞的數(shù)量。
　　3、過繼轉移記憶細胞，或用阻斷劑抑制肺TRM

7、細胞形成，分析肺TRM細胞在過敏性哮喘中的作用。
　　3.1取雌性6周齡BALB/c小鼠，隨機分為以下5組。分組如下：
　　肺單個核細胞過繼轉移組：致敏方案同1.1哮喘模型組，于實驗開始第35天(第二次致敏三周后)，取肺單個核細胞每兩只合并分別尾靜脈注射到一只正常小鼠體內(nèi)。過繼轉移小鼠于注射一周后每只腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50mg/kg），每只約100-120μl，待麻醉后，鼻腔吸入0.4%OVA激發(fā)液50μl，連續(xù)5天。

8、
　　肺記憶細胞過繼轉移組：致敏方案同1.1哮喘模型組，于實驗開始第35天(第二次致敏三周后)，取肺記憶細胞（TRM），余下操作同肺單個核細胞轉移組。
　　脾記憶細胞過繼轉移組：致敏方案同1.1哮喘模型組，于實驗開始第35天(第二次致敏三周后)，取脾記憶細胞，余下操作同肺單個核細胞轉移組。
　　僅激發(fā)組：正常飼養(yǎng)，至過繼轉移組注射一周后余下操作同肺單個核細胞轉移組。
　　加抑制劑組：每只小鼠分別于實驗開始0天和1

9、4天腹腔注射
　　0.02%OVA致敏液200μl,同時給予（腹腔注射）FTY720免疫抑制劑稀釋液10μl（每只小鼠100μg即按0.1mg/kg）。后續(xù)激發(fā)方案同1.1哮喘模型組。
　　3.2檢測分析同1.3-1.7檢測。
　　結果：
　　1、成功建立了小鼠哮喘模型
　　1.1IgE：對照組無IgE，哮喘模型組小鼠血清中OVA特異性IgE效價顯著高于對照組（P<0.01）。
　　1.2小鼠肺組織病

10、理變化:HE染色可見對照組小鼠肺泡壁結構完整，肺泡周圍僅有少量炎性細胞，支氣管壁平滑無增厚；哮喘模型組，肺組織被破壞，肺泡和支氣管周圍可見大量炎性細胞浸潤，支氣管壁增厚，管腔變窄；PAS染色可見對照組支氣管內(nèi)壁無粘液分泌，哮型模型組支氣管內(nèi)壁可見大量的粘液分泌。
　　1.3氣道高反應性:哮喘模型組較對照組氣道阻力(RI)顯著升高，肺動態(tài)順應性（Cdyn）顯著降低。
　　2、OVA致敏誘導了TRM的產(chǎn)生：與對照組相比，致敏組肺

11、組織中TRM細胞和脾細胞中TCM細胞的數(shù)量顯著升高（P<0.01）。
　　3、過繼轉移細胞組和加抑制劑組各項檢測結果
　　3.1IgE：與對照組相比，哮喘模型組，致敏組，加抑制劑組IgE效價顯著升高（P<0.01），但三組間沒有明顯差異；肺記憶細胞過繼轉移組、肺單個核細胞過繼轉移組、脾記憶細胞過繼轉移組、僅激發(fā)組，與對照組相比也有差異（P<0.05），組間無差異。
　　3.2氣道高反應性:結果顯示肺記憶細胞過繼轉移組在

12、Mch濃度達到最高劑量時較對照組氣道阻力(RI)顯著升高（P<0.05），但顯著低于肺單個核細胞過繼轉移組；肺單個核細胞過繼轉移組與對照組相比在Mch各個濃度氣道阻力(RI)都顯著升高；加抑制劑組在Mch低劑量時較哮喘模型組氣道阻力(RI)顯著降低（P<0.01），在高劑量時無明顯差異。
　　3.3小鼠肺組織病理變化
　　3.3.1HE染色可見：與對照組相比，肺單個核細胞過繼轉移組、肺記憶細胞過繼轉移組肺組織中炎性細胞浸潤不

13、多，肺泡也比較完整，但支氣管壁增厚，尤其肺單個核細胞過繼轉移組增厚更加明顯；加抑制劑組較哮喘模型組炎性細胞浸潤多集中在支氣管周圍，且支氣管壁增厚嚴重；僅激發(fā)組、脾記憶細胞過繼轉移組較對照組無明顯變化。
　　3.3.2PAS染色可見：肺單個核細胞過繼轉移組、肺記憶細胞過繼轉移組與對照組相比，支氣管壁增厚，且都有輕微粘液分泌；加抑制劑組支氣管內(nèi)壁增厚可見大量的粘液分泌，較哮喘模型組差別不明顯；僅激發(fā)組和脾記憶細胞過繼轉移組支氣管內(nèi)壁無

14、粘液分泌。提示肺TRM細胞參與了氣道粘液的產(chǎn)生，但不是唯一因素。
　　3.4瑞氏-吉姆薩染色后小鼠支氣管肺泡灌洗液細胞分類計數(shù)
　　結果顯示：哮喘模型組和加抑制劑組與對照組相比總的白細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞百分率都顯著升高（P<0.01），巨噬細胞百分率顯著降低（P<0.01）；加抑制劑組的嗜酸性粒細胞百分率顯著高于哮喘模型組（P<0.05），而淋巴細胞百分率顯著低于哮喘模型組（P<0.05）；肺單個核細胞

15、過繼轉移組與對照組比，白細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞百分率顯著升高（P<0.05），巨噬細胞百分率顯著降低。
　　3.5ELISA夾心法檢測支氣管肺泡灌洗液上清和肺勻漿液上清中細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-1β、MCP-1、MIP-1α的含量。
　　結果顯示：哮喘模型組和加抑制劑組與對照組相比Th2型細胞因子IL-4、促炎因子IL-1β、趨化因子MCP-1、MIP-1α含量顯著升高（P<0.05）；加抑

16、制劑組IL-4、MCP-1的含量更顯著高于哮喘模型組（P<0.05）；而哮喘模型組Th1型細胞因子IFN-γ的含量顯著高于對照組，加抑制劑組則顯著低于哮喘模型組（P<0.05）。肺單個核細胞過繼轉移組和肺記憶細胞過繼轉移組與對照組相比在支氣管肺泡灌洗液上清中MCP-1的含量顯著升高（P<0.05），其余細胞因子無明顯變化。在肺勻漿液上清中，加抑制劑組IL-1β的含量比哮喘模型組顯著降低（P<0.05）。
　　3.6RT-PCR檢測

17、肺組織中IL-5、IL-10、IL-13、IFN-γ、IL-1β、MCP-1、MIP-1α、RANTES、Eotaxin、GRO-α的mRNA表達。
　　結果顯示：哮喘模型組和加抑制劑組與對照組相比Th2型細胞因子IL-5、IL-10、IL-13、促炎因子IL-1β、趨化因子MCP-1、MIP-1α、RANTES、Eotaxin、GRO-α的mRNA表達量顯著升高（P<0.05），且加抑制劑組IL-5、IL-10、IL-13、MC

18、P-1、RANTES、Eotaxin、GRO-α的mRNA表達量顯著高于哮喘模型組（P<0.05）；哮喘模型組與對照組相比Th1型細胞因子IFN-γmRNA表達量顯著升高（P<0.05），而加抑制劑組、肺單個核細胞過繼轉移組、肺記憶細胞過繼轉移組、脾記憶細胞過繼轉移組、僅激發(fā)組與對照組相比表達量都顯著降低（P<0.05）；過繼轉移各組其他的細胞因子表達量與對照組相比無明顯變化。提示TRM細胞影響了Th1和Th2型細胞的平衡。