金翹熱毒清顆粒的抗炎作用研究.pdf

1、目的:
　　1、研究金翹熱毒清顆粒對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響，考察其在體內(nèi)的抗炎作用。
　　2、研究金翹熱毒清顆粒對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)的影響，考察其在體內(nèi)的抗炎作用。
　　3、用革蘭氏陰性菌流感嗜血桿菌感染小鼠建立的小鼠腹膜炎模型，考察金翹熱毒清顆粒對感染小鼠的抗菌保護(hù)作用。
　　4、用LPS激活A(yù)549細(xì)胞建立體外炎癥模型，考察金翹熱毒清顆粒對細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α含量的影響。
　　方

2、法:
　　1、建立二甲苯致小鼠耳腫脹模型，研究金翹熱毒清顆粒體內(nèi)給藥的抗炎作用
　　觀察選取檢疫合格的昆明種小鼠，隨機(jī)分為4組，分別為模型對照組、阿司匹林組(0.2 g.kg-1)、熱毒平組(21.84 g.kg-1)、金翹熱毒清顆粒組（15.6g.kg-1），各組藥物均用超純水配制。
　　2、建立冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)模型，研究金翹熱毒清藥物體內(nèi)給藥的抗炎作用。
　　觀察選取檢疫合格的ICR小鼠，隨

3、機(jī)分為4組，即為模型對照組、阿司匹林組(0.2 g.kg-1)、熱毒平組(21.84 g.kg-1)、金翹熱毒清顆粒組(15.6 g.kg-1)，各組均用超純水配制。末次給藥后約1小時，各試驗組動物均靜脈注射0.5％伊文思藍(lán)生理鹽水溶液，動物靜脈注射完畢后立即腹腔注射冰醋酸進(jìn)行致炎，20min后脫頸椎處死動物。
　　3、觀察金翹熱毒清顆粒對革蘭氏陰性菌流感嗜血桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株感染小鼠的體內(nèi)抗菌作用
　　將ICR小鼠隨機(jī)分

4、組，每組6只，每一稀釋度菌液腹腔注射感染1組小鼠，組內(nèi)小鼠全部死亡的最小致死量為MLD。測出每種菌株的MLD。
　　采用小鼠腹腔注射感染菌液建立小鼠腹膜炎模型，末次給藥后連續(xù)觀察7天，記錄動物的死亡數(shù)量，并計算死亡率。評價金翹熱毒清顆粒對感染小鼠的保護(hù)作用。
　　4、體外采用四氮唑藍(lán)MTT比色法檢測金翹熱毒清顆粒對A549細(xì)胞代謝活力的影響。A549細(xì)胞種植密度為5×103/孔，金翹熱毒清顆粒濃度(30、20、15、10、7

5、.5、5.0、0 mg/ml)，作用時間為3d，每組3個復(fù)孔。
　　5、篩選出用脂多糖LPS激活A(yù)549細(xì)胞作為體外炎癥模型，所需的LPS作用濃度和作用時間。
　　5.1 A549細(xì)胞種植密度為5×103/孔，LPS濃度(500、200、100、10、1、0μg/ml)，作用時間24h，每組3個復(fù)孔，收集細(xì)胞上清，選用雙夾心ELISA法測定TNF-α含量，確定LPS作用濃度。
　　5.2 A549細(xì)胞種植密度為5×10

6、3/孔，200μg/ml LPS作用時間(24、12、6、3、1、0h)，每組3個復(fù)孔，收集細(xì)胞上清，選用雙夾心ELISA法測定TNF-α含量，確定LPS作用時間。
　　6、采用LPS刺激A549細(xì)胞，體外觀察金翹熱毒清顆粒以不同給藥方式（細(xì)胞外直接滅活組、給藥治療組）對A549細(xì)胞代謝活力的保護(hù)作用。A549細(xì)胞種植密度為5×103/孔，LPS刺激細(xì)胞24h，金翹熱毒清顆粒濃度(7.5mg/ml)作用時間24h，每組3個復(fù)孔。<

7、br>　　7、采用LPS刺激A549細(xì)胞活化作為體外炎癥模型，觀察金翹熱毒清顆粒體外不同作用時間對A549細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α的影響。A549細(xì)胞種植密度為5×103/孔，200μg/ml LPS作用時間24h，7.5mg/ml金翹熱毒清顆粒（治療給藥方式），作用時間(24、12、6、3、0h)，每組3個復(fù)孔，收集細(xì)胞上清，選用雙夾心ELISA法測定TNF-α含量。
　　8、采用LPS刺激A549細(xì)胞活化作為體外炎癥模型，觀

8、察金翹熱毒清顆粒體外不同給藥方式對A549細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α的影響。A549細(xì)胞種植密度為5×103/孔，200μg/ml LPS作用時間24h，按金翹熱毒清藥物以不同給藥方式（細(xì)胞外直接滅活組、給藥治療組）作用，作用時間24h，每組3個復(fù)孔，收集細(xì)胞上清，選用雙夾心ELISA法測定TNF-α含量。
　　結(jié)果:
　　1.二甲苯致小鼠耳腫脹的實驗結(jié)果顯示，模型對照組、金翹熱毒清顆粒組的耳腫脹度分別是18.5±3.2，1

9、4.8±2.3，與模型對照組相比，金翹熱毒清顆粒能使二甲苯誘導(dǎo)的耳腫脹度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.冰醋酸誘導(dǎo)小鼠毛細(xì)血管通透性增高的結(jié)果顯示，模型對照組、金翹熱毒清顆粒組OD值分別是0.677±0.121，0.537±0.065，與模型對照組比較，金翹熱毒清顆粒組有降低冰醋酸誘導(dǎo)小鼠毛細(xì)血管通透性增高的作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3、觀察金翹熱毒清顆粒對革蘭氏陰性菌流感嗜血桿

10、菌的標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株感染小鼠的體內(nèi)抗菌作用
　　3.1 流感嗜血桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株的MLD預(yù)試驗結(jié)果范圍為106～107CFU/mL。
　　3.2 流感嗜血桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株感染小鼠實驗結(jié)果表明，模型對照組、金翹熱毒清顆粒組(20.8g.kg-1，15.6g.kg-1)的死亡率分別為100％、65％、80％，與模型對照組相比，金翹熱毒清顆粒組(20.8g.kg-1，15.6g.kg-1)可以降低感染小鼠的死亡數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

11、P＜0.01或P＜0.05)。
　　3.3 流感嗜血桿菌的臨床株感染小鼠實驗結(jié)果表明，模型對照組、金翹熱毒清顆粒組(20.8g.kg-1，15.6g.kg-1)的死亡率分別為100％、70％、80％，與感染菌液不給藥組相比，金翹熱毒清顆粒高、中劑量組可以降低感染小鼠的死亡率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。
　　4、MTT法檢測金翹熱毒清藥物對A549細(xì)胞代謝活力的實驗結(jié)果顯示，control組、金翹熱毒清顆

12、粒組(5.0、7.5、10、15、20、30 mg/ml)的細(xì)胞存活率分別為100％、94.77％、94.02％、80.18％、58.18％、48.24％、12.33％。與control組相比，金翹熱毒清顆粒組(5.0、7.5mg/ml)的細(xì)胞存活率沒有明顯的變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　5、體外用LPS激活A(yù)549細(xì)胞作為體外炎癥模型的實驗結(jié)果顯示:
　　5.1 control組、LPS模型組

13、（1、10、100、200、500μg/ml）的TNF-α的含量分別為311.44±70.41、461.19±156.72、824.89±64.18、1238.80±406.10、2694.53±417.81、3978.11±165.73pg/ml，與control組相比，LPS模型組(200、500μg/ml)的TNF-α的含量顯著升高。
　　5.2 control組、200μg/mlLPS模型組(3、6、12、24h)的TNF

14、-α的含量分別為372.02±203.27、137.45±184.91、227.98±132.01、470.78±353.658、2532.51±577.82pg/ml，與control組相比，LPS模型組(24h)的TNF-α的含量顯著升高。
　　6、體外MTT法檢測金翹熱毒清顆粒對LPS刺激A549細(xì)胞的保護(hù)作用實驗結(jié)果顯示:LPS模型組（200μg/ml）、細(xì)胞外直接滅活組和給藥治療組的細(xì)胞存活率分別為44.86％、77.1

15、0％、67.91％，與LPS模型組相比，細(xì)胞外直接滅活組和給藥治療組中的細(xì)胞存活率顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)
　　7、體外觀察金翹熱毒清顆粒不同作用時間對A549細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α影響的實驗結(jié)果顯示:control組、LPS模型組、LPS+金翹熱毒清顆粒組(24h)的TNF-α的含量分別為282.95±23.37、586.76±32.69 pg/ml，與LPS模型組相比，LPS+金翹熱毒清顆粒

16、組(24h)可以顯著降低A549細(xì)胞分泌的TNF-α含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　8、體外觀察金翹熱毒清顆粒不同作用時間對A549細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α影響的實驗結(jié)果顯示:control組、LPS模型組、細(xì)胞外直接滅活組和給藥治療組的TNF-α含量分別為188.62±70.96、1801.40±101.85、237.9±76.2、569.2±101.85pg/ml，與LPS模型組相比，細(xì)胞外直接滅活組和給藥治療

17、組均能顯著抑制A549分泌TNF-α，降低TNF-α的含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。細(xì)胞外直接滅活組和給藥治療組兩者相比，前者抑制A549細(xì)胞分泌TNF-α作用優(yōu)于后者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、金翹熱毒清顆?？梢砸种贫妆街率沟男∈蠖[脹度，提高小鼠的耳腫脹抑制率，提示其有抗炎作用。
　　2、金翹熱毒清顆粒可以抑制冰醋酸誘導(dǎo)的小鼠毛細(xì)血管通透性增高，提示其有抗炎作用。