沉默Keap1基因?qū)腔嚓P(guān)基因和砷代謝相關(guān)指標(biāo)的影響及在砷皮膚角化異常中的作用.pdf

1、目的：以慢病毒介導(dǎo)的Keap1基因沉默的人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞為模型細(xì)胞，研究Nrf2對(duì)角化相關(guān)基因和砷代謝相關(guān)指標(biāo)的影響及在砷致皮膚毒性中作用，為砷致皮膚毒性機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：1.Keap1 shRNA的構(gòu)建：利用RNAi技術(shù)，以人Keap1基因?yàn)榘谢颍O(shè)計(jì)Keap1基因特異性的小干擾RNA，構(gòu)建其shRNA，重組慢病毒表達(dá)載體，并進(jìn)行測序鑒定。2.慢病毒包裝：用重組成功的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，收集

2、、濃縮病毒上清液、測定其滴度；3.Keap1沉默Hacat細(xì)胞模型的構(gòu)建，構(gòu)建好的三種慢病毒分別感染HaCaT細(xì)胞（MOI=5）,感染48小時(shí)后，用1ug/ml的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。4.穩(wěn)定細(xì)胞株的鑒定：篩選出穩(wěn)定的細(xì)胞株，用實(shí)時(shí)熒光定量(Real-Time Quantitative PCR)檢測干擾效率。5.細(xì)胞培養(yǎng)與染毒：模型細(xì)胞與正常細(xì)胞按細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)。6.MTT法檢測細(xì)胞生長狀況，確定染毒濃度，染毒濃度別為LC50的

3、1/100、1/50、1/10。7.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況：參照相關(guān)試劑盒說明書。8.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞中Nrf2、K1、K10、INV、LOR、NF-кB、N6AMT1 mRNA的表達(dá)水平。9.ELISA法檢測細(xì)胞中COX-2、N6AMT1、SAM、HCY的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.慢病毒干擾載體構(gòu)建測序結(jié)果顯示重組載體構(gòu)建成功。2.慢病毒滴度測試結(jié)果：依據(jù)滴度（TU/ml）=細(xì)胞數(shù)×百分比×MOI(1)×病毒

4、稀釋倍數(shù)×10^3選取最佳滴度的病毒。3.選取Keap1 shRNA1 Hacat細(xì)胞，其基因的沉默效率為71％。4.混合砷液染毒2.90μmol/L、5.80μmol/L、29.00μmol/L，分別為低、中、高劑量組，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組染毒濃度為0μmol/L。5.細(xì)胞增殖：2.90μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞，細(xì)胞明顯增殖；5.80μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞72h開始出現(xiàn)明顯抑制；29.00μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞48h

5、開始明顯抑制細(xì)胞增殖?？瞻讓?duì)照細(xì)胞增值率略低于0μmol/L染毒組。6.細(xì)胞凋亡：2.90μmol/L染毒時(shí)，各時(shí)間段細(xì)胞凋亡率均低于正常對(duì)照組，提示2.90μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞，在促進(jìn)細(xì)胞增殖同時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率降低；5.80μmol/L、29.00μmol/L染毒組隨著染毒劑量的增加，細(xì)胞凋亡率也逐漸增加。7.2.90μmol/L、5.80μmol/L混合砷染毒Keap1沉默細(xì)胞8h、24h后能促進(jìn)Nrf2、K1、K10、I

6、NV、N6AMT1、NF-κB mRNA的表達(dá)上調(diào)；29.00μmol/L的混合砷染毒72h可使Keap1沉默細(xì)胞中Nrf2、K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。8.2.90μmol/L、5.80μmol/L混合砷染毒Keap1沉默細(xì)胞能促進(jìn)N6AMT1、COX-2、SAM、HCY蛋白的表達(dá)；29.00μmol/L混合砷染毒Keap1沉默細(xì)胞 N6AMT1、SAM、HCY蛋

7、白的表達(dá)量下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；29.00μmol/L COX-2蛋白的表達(dá)量仍遠(yuǎn)于對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.細(xì)胞增殖：2.90μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞，細(xì)胞明顯增殖；5.80μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞72h開始出現(xiàn)明顯抑制；29.00μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞48h開始明顯抑制細(xì)胞增殖。空白對(duì)照細(xì)胞增值率略低于0μmol/L染毒組，提示沉默Keap1基因后Nrf2高表達(dá)有利

8、于細(xì)胞的增殖，混合砷液對(duì)細(xì)胞的增殖影響具有時(shí)間-劑量依賴性。細(xì)胞凋亡：2.90μmol/L混合砷液染毒細(xì)胞，在促進(jìn)細(xì)胞增殖同時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率降低；5.80μmol/L、29.00μmol/L染毒組隨著染毒劑量的增加，細(xì)胞凋亡率也逐漸增加；隨著染毒時(shí)間的延長，細(xì)胞的凋亡率也上升，提示混合砷液誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有一定的時(shí)間-劑量依賴性。2.混合砷染毒Keap1沉默HaCaT細(xì)胞，Nrf2處于高表達(dá)狀態(tài)，隨著染毒時(shí)間延長、染毒濃度增加基因有下調(diào)

9、趨勢，但明顯高于未轉(zhuǎn)染組。3.混合砷染毒能使Keap1沉默HaCaT細(xì)胞中K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA表達(dá)發(fā)生改變，隨著染毒時(shí)間延長、染毒濃度增加能使基因表達(dá)逐漸下調(diào)。4.Keap1沉默HaCaT細(xì)胞染毒后在8h、24h檢測到LORmRNA表達(dá)為陰性，2.90μmol/L、5.80μmol/L染毒組在72h檢測到LOR mRNA上調(diào)，29.00μmol/L組在48h、72h檢測到LOR mRNA上調(diào)。5.混合