慢病毒介導(dǎo)的HDAC1基因沉默對(duì)hUC-MSCs神經(jīng)分化和TBI治療的促進(jìn)作用.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是一種致死致殘率極高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）損傷性疾病，給患者、家庭社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。TBI的病理機(jī)制、影響因素復(fù)雜且不統(tǒng)一。近年來(lái)，干細(xì)胞替代療法為CNS損傷疾病的治療帶來(lái)希望。臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cell，hUC-MSC)是一

2、類具有強(qiáng)大增殖分化能力且倫理爭(zhēng)議小的干細(xì)胞，具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是干細(xì)胞在體內(nèi)存活和分化效率低是干細(xì)胞治療的瓶頸。因此，探討更為安全、有效的誘導(dǎo)分化方式對(duì)于干細(xì)胞移植治療TBI尤為關(guān)鍵。
　　表觀遺傳學(xué)是研究核苷酸序列不變，但是基因表達(dá)發(fā)生有效調(diào)控的一門學(xué)科。組蛋白乙酰化修飾是一種常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)修飾方法，它通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)乙?；福℉AT）和去乙?；福℉DAC）的動(dòng)態(tài)平衡來(lái)調(diào)控干細(xì)胞的增殖和定向分化。研究表明，與未分化的干

3、細(xì)胞相比，已分化的成熟神經(jīng)元中HDAC1的表達(dá)量降低。HDAC1、HDAC2與其他因子組成阻遏復(fù)合物共同調(diào)控了干細(xì)胞的增殖和分化，而敲除HDAC2可能會(huì)抑制神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖。因此，深入研究HDAC1在干細(xì)胞神經(jīng)分化和神經(jīng)修復(fù)中的作用和機(jī)制，對(duì)于治療 CNS損傷性疾病十分必要。
　　目的：
　　本課題以HDAC1為研究靶點(diǎn)，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究慢病毒介導(dǎo)shRNA靶向下調(diào)HDAC1的表達(dá)對(duì) hUC-MSCs增殖和神經(jīng)分化的影響；然

4、后通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)LV-HDAC1shRNA感染的MSCs對(duì)TBI小鼠的神經(jīng)修復(fù)和保護(hù)作用。該研究旨在揭示HDAC1在調(diào)控hUC-MSCs神經(jīng)分化中的作用機(jī)制，為開(kāi)展干細(xì)胞分化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控和提高干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療效果奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.體外實(shí)驗(yàn)研究慢病毒介導(dǎo)shRNA下調(diào)HDAC1表達(dá)對(duì)hUC-MSCs增殖和向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的影響
　　采用組織貼壁法分離培養(yǎng)hUC-MSCs；篩選靶向下調(diào)H

5、DAC1表達(dá)的shRNA片段，合成慢病毒感染干細(xì)胞，建立穩(wěn)定的慢病毒感染細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)分為L(zhǎng)V-HDAC1shRNA組和hUC-MSCs組。CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的周期、qRT-PCR、Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞神經(jīng)分化相關(guān)基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)各組細(xì)胞在神經(jīng)誘導(dǎo)微環(huán)境下神經(jīng)元遷移蛋白(Doublecortin，DCX)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific

6、 enolase，NSE)的表達(dá)。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究LV-HDAC1shRNA感染的hUC-MSCs對(duì)TBI小鼠的神經(jīng)修復(fù)作用
　　80只C57/BL6J小鼠利用腦立體定位儀和顱腦打擊器制作小鼠皮質(zhì)損傷創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）模型，隨機(jī)分為Sham組、Vehicle組、MSCs組+NCshRNA、MSCs+shRNA組（每組20只）。CV染色評(píng)估小鼠腦損傷體積；采用干濕重法檢測(cè)TBI后腦水腫情況；采用mNSS評(píng)分評(píng)估小鼠神

7、經(jīng)功能缺損情況；采用Morris水迷宮法、新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠血清中的SOD、MDA、GSH、GSH-Px、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的表達(dá)情況；采用qRT-PCR、Western Blot分別檢測(cè)小鼠病灶部位神經(jīng)分化相關(guān)基因表達(dá)變化和損傷部位乙?；?。
　　結(jié)果:
　　1.與對(duì)照組相比，LV-HDAC1shRNA感染hUC-MSCs后HDAC1的表達(dá)下調(diào)，而

8、H3K9Ac表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LV-HDAC1 shRNA在3d后可明顯促進(jìn)hUC-MSCs的增殖，增加S期細(xì)胞比例（P<0.05）；在相同神經(jīng)誘導(dǎo)分化條件下LV-HDAC1 shRNA組神經(jīng)分化效率增加，細(xì)胞中DCX、NSE的表達(dá)明顯升高（P<0.05），而神經(jīng)分化相關(guān)基因（Ngn2、Mash1等）的表達(dá)顯著增加（P<0.05）。
　　2.成功建立TBI小鼠模型；通過(guò)Morris水迷宮、新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)

9、、腦含水量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Vehicle組相比，MSCs+NCshRNA組、MSCs+shRNA組學(xué)習(xí)、記憶能力明顯改善（P<0.05）、腦水腫體積顯著減?。≒<0.05）；ELISA結(jié)果顯示各治療組28d血清中的SOD、GSH、GSH-Px、IL-4、IL-10的表達(dá)顯著增加（P<0.05），而MDA、TNF-α、IL-1β的表達(dá)明顯降低（P<0.05）；Western Blot結(jié)果顯示：術(shù)后14d，與Vehicle組相比，MSCs+sh

10、RNA組小鼠損傷部位乙?；皆黾用黠@（P<0.05）。qRT-PCR結(jié)果顯示：術(shù)后28d，較Vehicle組，MSCs+shRNA組病灶部位神經(jīng)分化相關(guān)基因DCX、MAP2和海馬中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、NGF、NT3的表達(dá)均有明顯上調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1. LV-HDAC1 shRNA感染hUC-MSC后，HDAC1的表達(dá)被靶向下調(diào)、細(xì)胞乙?；教岣?。同時(shí)，細(xì)胞增殖變快、S期細(xì)胞比例增加，調(diào)控神經(jīng)發(fā)育相