沙奎那韋脂質(zhì)核殼納米載體突破口服吸收屏障的研究.pdf

1、口服給藥途徑是使用最為廣泛，也是最容易被患者接受的一種給藥途徑，特別是對于慢性疾病的治療，口服給藥在患者順應(yīng)性方面大大優(yōu)于其他給藥途徑。然而對于某些藥物來說，如抗HIV藥物，抗腫瘤藥物等，由于本身性質(zhì)（如水溶性低，因P-糖蛋白的外排作用導(dǎo)致的膜通透性差）以及胃腸道內(nèi)各種吸收屏障導(dǎo)致口服吸收差，生物利用度低。因此，研究如何提高這類藥物水溶性和膜通透性，有效克服胃腸道吸收屏障，是提高口服藥物生物利用度的關(guān)鍵。
　　本課題以沙奎那韋（S

2、QV）為模型藥物，針對該藥口服給藥后水溶性差，膜通透性差的缺點，設(shè)計構(gòu)建了兩種新型納米制劑：①純藥物納米粒；②脂質(zhì)膜修飾的純藥物納米粒，研究其對沙奎那韋口服吸收的影響，并進行吸收機制的研究。首先將沙奎那韋原料藥粉末采用反溶劑沉淀-高壓均質(zhì)法制備成納米級別純藥物顆粒，以提高藥物的溶解速度。然后在納米晶體表面包被一層脂質(zhì)膜制成一種核-殼形式的納米載體，同時在載體表面修飾具有P-糖蛋白（P-gp）抑制作用的聚合物TPGS，克服上皮細胞屏障中P

3、-gp對底物藥物的外排。并在細胞水平研究兩種藥物納米載體在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程。最后在動物水平研究納米載體對于提高SQV口服吸收的作用。
　　本文第一部分對沙奎那韋納米載體進行制備和表征。首先采用反溶劑沉淀-高壓均質(zhì)聯(lián)用的方法制備了沙奎那韋納米級純藥物顆粒，然后采用薄膜水化法制備了脂質(zhì)膜包裹純藥納米粒的核殼載體。所得晶態(tài)純藥納米粒（Crystal pure nanodrug，CPN）粒徑為（205.93±3.74） nm，無定型純藥納米

4、粒（amorphous pure nanodrug，APN）粒徑為（191.30±5.18）nm，脂質(zhì)核殼納米載體粒徑為（241.40±15.23）nm，其粒徑分布均較為均一。電鏡下可見不同的高分子材料作穩(wěn)定劑制備的純藥納米粒具有不同的形態(tài)：以PSS為穩(wěn)定劑時，純藥納米粒呈長條形棒狀結(jié)晶，而以TPGS為穩(wěn)定劑時純藥納米粒呈不規(guī)則塊狀。X-射線粉末衍射及差示量熱掃描結(jié)果顯示SQV原料藥粗晶（SQV coarse crystals）及CPN

5、呈晶態(tài)且二者晶型一致；而APN則呈無定型。在APN外面包裹一層脂質(zhì)膜后（Lipo@APN），在電鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察呈明顯核殼結(jié)構(gòu)，即膜狀結(jié)構(gòu)覆蓋于純藥納米粒表面，表面變得較光滑。體外釋放實驗顯示，兩組純藥納米粒CPN和APN在pH6.8的磷酸緩沖液釋放介質(zhì)中釋放明顯快于SQV coarse crystals組，十分鐘累積溶解即達50％，粗晶體只溶解了15%。而將APN脂質(zhì)膜包裹后藥物釋放速度明顯變慢，8小時累積釋放量不到20

6、%。以上結(jié)果表明，將原料藥粗晶體制備成晶態(tài)純藥納米粒或無定形純藥納米粒后藥物的溶解速度得到明顯改善。
　　第二部分，以Caco-2細胞作為細胞模型，對載體進行細胞水平研究。采用激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀對熒光標記的各制劑的細胞攝取進行定性和定量研究。結(jié)果顯示，Lipo@APN載體的胞內(nèi)熒光強度明顯高于 CPN，APN和 coarse crystals組，表明 Caco-2細胞對Lipo@APN的攝取顯著高于其它制劑組（P<0.0

7、5）。以培養(yǎng)21天后的Caco-2細胞單層膜為模型，考察藥物的跨膜轉(zhuǎn)運能力。經(jīng)計算， SQVcoarse crystals、CPN、APN和Lipo@APN組制劑Papp值分別為，（2.25±0.44）×10-6、（4.87±0.43）×10-6、（5.05±0.82）×10-6和（8.13±0.96）×10-6 cm/sec。Lipo@APN組Papp值約為SQV coarse crystals組的3.61倍，跨膜轉(zhuǎn)運量顯著提高（P<

8、0.05）。通過維拉帕米抑制細胞單層膜上的藥物外排泵P-gp后，SQV coarse crystals，CPN，APN組跨膜轉(zhuǎn)運量提高，而 Lipo@APN組跨膜轉(zhuǎn)運量變化不大（ P＞0.05），說明Lipo@APN不被P-gp外排。載體轉(zhuǎn)胞吞抑制結(jié)果顯示，細胞膜上脂筏被抑制后，Lipo@APN跨膜轉(zhuǎn)運量明顯降低（P<0.01），說明其是通過脂筏介導(dǎo)的方式完成轉(zhuǎn)胞吞過程。載體胞內(nèi)轉(zhuǎn)移途徑研究結(jié)果顯示，熒光標記的Lipo@APN能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

9、和高爾基體很好的共定位，而與溶酶體共定位較少，說明Lipo@APN進入細胞后主要經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體途徑轉(zhuǎn)運。
　　第三部分，以雄性SD大鼠為動物模型，對藥物吸收機制及藥物動力學進行評價。對大鼠灌胃給藥熒光標記各組制劑，1小時后取出各腸段進行切片，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察各制劑組在腸組織中的吸收分布情況。結(jié)果顯示，Lipo@APN納米載體在腸組織中熒光強度最強，且進入了腸組織粘膜固有層中。為了進一步研究納米粒在整個腸段的轉(zhuǎn)移情況

10、，將取出的消化道在活體成像儀下觀察熒光分布。結(jié)果顯示，口服給藥30min后，觀察到四種制劑大部分位于胃和十二指腸內(nèi)；1.5小時后，部分制劑仍在胃內(nèi)滯留，而一部分到達空腸的中下部；3小時后，大部分制劑已經(jīng)經(jīng)胃排空，分布在整個小腸，結(jié)果顯示四種制劑的胃排空和小腸運輸速率沒有明顯的區(qū)別。然而，從整個消化道的熒光強度隨時間變化來看，與其余制劑組在同一時間點相比Lipo@APN熒光強度變得更弱，而其余組在小腸上部仍可觀察到較強熒光存在。結(jié)果表明盡