沙利度胺對正常及組胺刺激后人真皮成纖維細胞分泌的TGF-β1、MMP-1、TIMP-1基因表達的影響.pdf

1、背景：成纖維細胞是皮膚真皮層最重要的細胞之一，附著在膠原纖維上，可以合成和分泌大量的膠原蛋白，這對于維持皮膚的彈性和韌性有著重要作用。許多疾病的發(fā)生與膠原蛋白的代謝異常有明顯相關(guān)性。有研究表明系統(tǒng)性硬皮病和病理性瘢痕是由于成纖維細胞增殖活性增強和以膠原蛋白為主的細胞外基質(zhì)過度沉積造成的。細胞因子中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)可以促進成纖維細胞的增殖，刺激膠原蛋白合成，同時可以刺激膠原酶的產(chǎn)生。TGF-β1被認為在瘢痕形成中最重要的

2、細胞因子,可以強烈促進細胞外基質(zhì)的沉積。在正常情況細胞外基質(zhì)的合成與降解保持著動態(tài)平衡，以維持組織的正常結(jié)構(gòu)與功能。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)與其抑制因子基質(zhì)金屬抑制蛋白酶(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMPs)在這種平衡中起著重要作用。MMP-1是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要一員，在創(chuàng)傷修復(fù)中對啟動膠原的降解起著關(guān)鍵作用，是膠

3、原降解的關(guān)鍵酶。TIMP-1是MMP-1最重要的抑制因子，可以與MMP-1按比例1:1形成復(fù)合體抑制該酶的活性。隨著沙利度胺(THD)在麻風(fēng)、結(jié)節(jié)性紅斑等疾病治療上取得良好效果，研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。目前有實驗證明沙利度胺可以通過抑制TGF-β、TNF-α因子對抗肺纖維化的進程。大量實驗均已證明肥大細胞分泌的組胺可以刺激成纖維細胞的增殖和膠原合成增多，故本實驗用組胺作為成纖維細胞的刺激因子誘導(dǎo)纖維化病理細胞模

4、型。本課題通過體外培養(yǎng)人成纖維細胞，研究沙利度胺對組胺刺激后人成纖維細胞分泌的TGF-β1、MMP-1及TIMP-1的影響。
　　目的：探討沙利度胺對正常及組胺刺激后人真皮成纖維細胞分泌的TGF-β1、MMP-1、TIMP-1的mRNA的影響。
　　方法：
　　1.使用體積分數(shù)為20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，通過消化-組織塊混合法對人正常真皮成纖維細胞進行原代培養(yǎng)。
　　2.通過波形蛋白免疫組化染色進行細胞鑒定

5、。
　　3.實驗分組
　　實驗分為空白對照組（正常成纖維細胞）、沙利度胺組、組胺組、組胺+沙利度胺組。
　　4.經(jīng)前期實驗測定，沙利度胺的濃度在10-5mol/L時對正常成纖維細胞的增殖活性無影響，經(jīng)查閱大量文獻，本實驗所用的組胺濃度為100UM。
　　5.采用SYBR Green I染料法熒光定量PCR測定TGF-β1的mRNA的表達情況及進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　按上述分組的要求處理細胞，每組均設(shè)三個樣本，

6、接種在25mL培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。24h后提取各組的總RNA。應(yīng)用熒光定量PCR對TGF-β1 mRNA基因的表達量進行測定，并用以上測得數(shù)值進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　6.采用SYBR Green I染料法熒光定量PCR測定MMP-1及TIMP-1的mRNA的表達情況及進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　按方法5得到MMP-1及TIMP-1 mRNA基因表達量，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.沙利度胺對組胺誘導(dǎo)后人成纖維細胞

7、TGF-β1 mRNA的影響。
　　空白組、沙利度胺組、組胺組、組胺+沙利度胺組的 TGF-β1 mRNA的RQ值分別為0.9837±0.0125、0.849±0.0276、2.5653±0.0935、0.648±0.0321。各組RQ值不全相等(P＜0.05)，組內(nèi)兩兩比較時均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果提示：經(jīng)組胺誘導(dǎo)后TGF-β1 mRNA表達量增加。沙利度胺可抑制正常的人真皮成纖維細胞TGF-β1 mRNA的表達，

8、且經(jīng)過組胺誘導(dǎo)后其抑制作用更顯著。
　　2.沙利度胺對組胺誘導(dǎo)后人成纖維細胞MMP-1mRNA的影響。
　　空白組、沙利度胺組、組胺組、組胺+沙利度胺組的MMP-1mRNA的 RQ值分別為0.9973±0.0074、1.2773±0.0351、1.071±0.0137、1.7523±0.0334。各組RQ值不全相等(P＜0.05)，且組內(nèi)兩兩比較時均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果提示：組胺和沙利度胺可以促進正常人真皮成

9、纖維細胞MMP-1mRNA的表達，經(jīng)過組胺誘導(dǎo)后沙利度胺對其促進作用更明顯。
　　3.沙利度胺對組胺誘導(dǎo)后人成纖維細胞TIMP-1mRNA的影響。
　　空白組、沙利度胺組、組胺組、組胺+沙利度胺組的TIMP-1mRNA的RQ值分別為0.997±0.007、0.1687±0.0015、0.9563±0.0312、0.1173±0.005。對各組的RQ值進行統(tǒng)計學(xué)分析，四組數(shù)據(jù)方差不齊。空白組與組胺組相比較沒有顯著性差異；沙利度

10、胺組較空白組TIMP-1mRNARQ值降低，兩者間有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；組胺+沙利度胺組與組胺組相比較RQ降低，兩者間有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；組胺+沙利度胺組與沙利度胺組相比較RQ降低，兩者間有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示：沙利度胺可以抑制正常成纖維細胞TIMP-1mRNA表達，在組胺誘導(dǎo)后對其抑制作用更明顯。
　　結(jié)論
　　1.經(jīng)100UM組胺誘導(dǎo)后成纖維細胞TGF-β1 mRNA表達量明顯增加。