MACF1在胃癌中的表達(dá)及CRISPR-Cas9敲除MACF1對(duì)胃癌體外生物學(xué)行為的影響.pdf

1、胃癌(gastric cancer, GC)是全球死亡率第二位的惡性腫瘤，胃癌的發(fā)病率高，治療效果差，根治率低，在消化道腫瘤中發(fā)病率和死亡率占第一位，是危害人類健康的主要惡性腫瘤之一。
　　本研究擬探討MACF1在胃癌中的表達(dá)情況及預(yù)后的關(guān)系，為胃癌的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。并采用CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)，敲除胃癌細(xì)胞系中的MACF1基因的表達(dá)，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為及功能的變化，從而研究MACF1在胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的

2、作用。
　　本研究主要分為以下三個(gè)部分:
　　第一部分：MACF1在胃癌中的表達(dá)情況及與臨床預(yù)后之間的關(guān)系
　　目的：
　　探討MACF1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理學(xué)特征和臨床預(yù)后之間的關(guān)系
　　方法：
　　1.構(gòu)建組織芯片并采用免疫組化法(IHC)檢測(cè)MACF1在107例胃癌組織及107例相對(duì)應(yīng)正常組織的胃癌上皮中的表達(dá)情況;
　　2.對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，獲得5年隨訪資料，并結(jié)合

3、MACF1在胃癌上皮組織中的表達(dá)情況，分析MACF1表達(dá)與臨床病理和預(yù)后之間的關(guān)系;
　　3.免疫組化結(jié)果分析和判定:每張芯片免疫組化結(jié)果均由3位病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲評(píng)價(jià)，芯片上的每個(gè)點(diǎn)評(píng)價(jià)至少5個(gè)高倍視野，每個(gè)高倍視野下的細(xì)胞不應(yīng)少于100個(gè)。然后根據(jù)免疫組化的著色強(qiáng)度和著色范圍進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用Spearman相關(guān)分析進(jìn)行有序變量之間的聯(lián)系的分析

4、，采用Pearson's卡方檢驗(yàn)分類變量之間的比較;采用Kaplan-Meier法分析MACF1表達(dá)與胃癌患者生存預(yù)后之間的關(guān)系并繪制生存曲線，采用log-rank檢驗(yàn)比較組間的差異;采用Cox風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析，評(píng)估各個(gè)指標(biāo)對(duì)患者的預(yù)后生存的獨(dú)立影響，包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等等，從而分析與胃癌患者預(yù)后生存相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，雙側(cè)檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.

5、免疫組化結(jié)果顯示:在107例胃癌癌旁正常組織中，24例染色陽性(22.4％)，83例染色陰性(77.6％);107例胃癌組織中，76例染色陽性(71.0％)，31例染色陰性(29.0％)。MACF1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)率為71％(76/107)，明顯高于其相應(yīng)的癌旁正常胃粘膜組織22.4％(24/107)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);
　　2.MACF1過表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)和腫瘤分期密切相關(guān)，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

6、p＜0.05);
　　3.總體胃癌術(shù)后患者5年生存生存率42.5％(45/107)，MACF1蛋白表達(dá)升高的胃癌患者的5年生存率35.2％(25/76)明顯低于MACF1蛋白低表達(dá)的胃癌患者的5年生存率55.6％(20/31)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.034);
　　4.MACF1的過表達(dá)、臨床分期、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)都是胃癌患者術(shù)后總體生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　第二部分：CRISPR/Cas9靶向敲除MACF1

7、基因改造胃癌細(xì)胞系
　　目的：
　　探討MACF1在不同胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及并利用CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)靶向敲除MACF1以獲得突變型胃癌細(xì)胞系。
　　方法：
　　1.采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Q-PCR)和蛋白印跡(Western-blot)的方法檢測(cè)MACF1在5個(gè)不同的胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC-27、SNU-1、KATO-Ⅲ、NCI-N87中的表達(dá)情況，篩選表達(dá)量較高的細(xì)胞系;
　　2.

8、MACF1 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建:將MACF1的全基因組序列輸入Vector NTI軟件中，選定合適外顯子并在Zifit工具網(wǎng)站中獲取合適的sgRNA序列，并加入BsaⅠ酶切位點(diǎn)，CRISPR/Cas9及引導(dǎo)的sgRNA轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞后，Cas9在切割基因組的同時(shí)也會(huì)切割同樣含有靶序列的質(zhì)粒reporter，將sgRNA和reporter合成后，稀釋退火，連接轉(zhuǎn)化、挑菌、擴(kuò)大培養(yǎng)，質(zhì)粒提取;
　　3.通過轉(zhuǎn)染EGFP綠色熒

9、光蛋白，篩選轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與Lip2000的最佳轉(zhuǎn)染比例:質(zhì)粒的質(zhì)量與Lip2000體積比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，選取最佳轉(zhuǎn)染比例;
　　4.使用Lip2000分別將sgRNA、reporter、cas9轉(zhuǎn)染進(jìn)JH293工具細(xì)胞，篩選切割效率較高的sgRNA;
　　5.使用Lip2000分別將切割效率較高的sgRNA、reporter、cas9轉(zhuǎn)染進(jìn)工具細(xì)胞目的細(xì)胞AGS、S

10、NU-1，48小時(shí)后觀察轉(zhuǎn)染效率;
　　6.流式分選細(xì)胞儀分選目的細(xì)胞:將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞消化制備單細(xì)胞懸液，在流式細(xì)胞儀中分選單個(gè)目的細(xì)胞，種于96孔板中;
　　7.單克隆細(xì)胞的培養(yǎng)及細(xì)胞收集:培養(yǎng)1-2周后，觀察96孔板中的單克隆細(xì)胞團(tuán)，待96孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)至50％左右時(shí)，分至另一96孔板中。
　　結(jié)果：
　　1.Q-PCR和Western-blot結(jié)果顯示: MACF1在5個(gè)不同的胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC-27、

11、SNU-1、KATO-Ⅲ、NCI-N87等均有表達(dá)，且Q-PCR與WB二者結(jié)果基本一致，均為NCI-N87表達(dá)量最高，其次為AGS、SNU-1、HGC-27、KATO-Ⅲ;
　　2.成功構(gòu)建MACF1 CRISPR/Cas9載體，共構(gòu)建5個(gè)sgRNA、2個(gè)reporter，并轉(zhuǎn)化、搖菌、擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒;
　　3.質(zhì)粒與Lip2000最佳轉(zhuǎn)染比例分別為:AGS1∶2、HGC-271∶2、SNU-11∶3、KATO-Ⅲ1∶3

12、、NCI-N87的Lip2000轉(zhuǎn)染效率極低;
　　4.JH293工具細(xì)胞篩選的sgRNA和reporter分別為reporter1、sgRNA2;
　　5.成功將sgRNA2和reporter1轉(zhuǎn)染進(jìn)入AGS和SNU-1，48小時(shí)后流式分選
　　6.流式分選AGS和SNU-1的單細(xì)胞懸液，種于96孔板中，每個(gè)細(xì)胞分別收集4個(gè)96孔板;
　　7.單克隆細(xì)胞團(tuán)形成后，并長(zhǎng)成96孔板的50％，分盤培養(yǎng)，AGS細(xì)胞平均

13、單克隆形成率為19/96(19.79％)，SNU-1細(xì)胞平均單克隆形成率為25/96(25.78％)。AGS細(xì)胞存活率48.68％; SNU-1細(xì)胞存活率46.46％。
　　8.T7錯(cuò)配酶切鑒定:37個(gè)AGS細(xì)胞株有10個(gè)酶切鑒定結(jié)果為陽性，陽性率27％; SNU-1共驗(yàn)證8株，其中7個(gè)鑒定結(jié)果為陽性，陽性率為87.5％;將陽性的AGS和SNU-1全部送測(cè)序。
　　9.DNA測(cè)序并篩選AGS野生細(xì)胞系2株，純合突變（正負(fù)）2

14、株，雜合突變（負(fù)負(fù)）5株;SNU野生細(xì)胞系2株，一條染色體敲除細(xì)胞系2株，兩條染色體同時(shí)敲除細(xì)胞系6株;
　　10.Western-blot驗(yàn)證得到的細(xì)胞株，MACF1基因純合突變細(xì)胞系蛋白表達(dá)缺失，MACF1雜合突變細(xì)胞系蛋白表達(dá)較MACF1野生型減少。
　　第三部分：MACF1基因敲除對(duì)胃癌AGS細(xì)胞系體外生物學(xué)行為的影響
　　目的：
　　探討CRISPR/Cas9靶向敲除MACF1基因后對(duì)胃癌AGS細(xì)胞系生

15、物學(xué)行為的影響。
　　方法：
　　1.MTS法檢測(cè)敲除MACF1對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖能力的影響;
　　2.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲除MACF1對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的遷移能力的影響;
　　3.平板克隆檢測(cè)敲除MACF1對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的克隆形成能力的影響;
　　4.軟瓊脂克隆形成檢測(cè)敲除MACF1對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的克隆形成能力的影響;
　　5.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲除MACF1對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的遷移能力的影

16、響;
　　6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)敲除MACF1對(duì)胃癌AGS細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果：
　　1.MACF1敲除后的胃癌AGS細(xì)胞形態(tài)變化，梭形變?yōu)轭悎A形;
　　2.MTS結(jié)果顯示MACF1敲除后胃癌AGS細(xì)胞增殖能力減弱;
　　3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MACF1敲除后胃癌AGS細(xì)胞增殖能力減弱;
　　4.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MACF1敲除后胃癌細(xì)胞克隆形成能力減弱;
　　5.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)

17、果顯示MACF1敲除后胃癌細(xì)胞克隆形成能力減弱;
　　6.Transwell結(jié)果顯示MACF1敲除后胃癌AGS細(xì)胞的遷移能力減弱;
　　7.流式結(jié)果顯示MACF1敲除后細(xì)胞阻滯在G2/M有絲分裂期。
　　結(jié)論：
　　1.CRISPR/Cas9敲除MACF1基因的表達(dá)可以使胃癌細(xì)胞形態(tài)變化，細(xì)胞極性消失，形態(tài)由梭形變?yōu)轭悎A形，可能與MACF1蛋白參與細(xì)胞骨架形成有關(guān);
　　2.CRISPR/Cas9敲除MAC