基于“痰”致病理論研究橙皮苷對動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)蛋白聚糖的作用.pdf

1、目的:
　　動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是常見心血管疾病的一種，目前已經(jīng)是危險(xiǎn)人類健康的重大疾病之一。在AS的發(fā)生發(fā)展過程中，血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移在其中起到重要作用，同時(shí)過程中伴隨著一系列的炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)代研究表明AS病變中的脂質(zhì)沉積是繼發(fā)于動(dòng)脈基質(zhì)的改變之后，細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白聚糖的堆積導(dǎo)致了脂質(zhì)沉積，進(jìn)而引起AS病變的形成。中醫(yī)中“痰”理論認(rèn)為蛋白聚糖病變與“痰”有密切關(guān)系，化痰方藥在治療AS中有良好的療效。本研究采用氧化型低密度脂

2、蛋白誘導(dǎo)小鼠血管平滑肌細(xì)胞建立AS細(xì)胞模型，探討橙皮苷對AS模型血管平滑肌細(xì)胞動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)蛋白聚糖表達(dá)與脂質(zhì)代謝的影響。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)采用MTT法測定不同濃度氧化型低密度脂蛋白對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，篩選造模濃度;測定不同濃度橙皮苷對氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響;通過DMMB法檢測橙皮苷對血管平滑肌細(xì)胞生成糖胺聚糖的影響;采用Western Blotting法檢測橙皮苷對血管平滑肌細(xì)胞bi

3、glycan和decorin蛋白表達(dá)的影響;通過油紅0染色法檢測橙皮苷對血管平滑肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響;Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測橙皮苷對氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響。
　　結(jié)果:
　　1、氧化型低密度脂蛋白可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖，50μg/mL的ox-LDL可以誘導(dǎo)AS平滑肌細(xì)胞模型成立。與空白對照組比較，在25μg/mL-50μg/mL范圍內(nèi)，血管平滑肌細(xì)胞的增殖能力明顯上升(P＜0.01)

4、，說明在這個(gè)濃度范圍內(nèi)的ox-LDL對血管平滑肌細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用。其中，ox-LDL50μg/mL組的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于ox-LDL25μg/mL組，說明在25μg/mL-50μg/mL范圍內(nèi)，ox-LDL對血管平滑肌細(xì)胞的增殖能力有濃度依賴關(guān)系。但當(dāng)ox-LDL濃度在75μg/mL-125μg/mL范圍內(nèi)卻表現(xiàn)出抑制血管平滑肌的作用，而且抑制作用較強(qiáng)。說明ox-LDL在較低濃度時(shí)對血管平滑肌細(xì)胞的增殖表現(xiàn)為促進(jìn)作用，當(dāng)濃度升高

5、是反而會(huì)發(fā)揮抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。
　　2、橙皮苷在200-250μg/mL濃度范圍內(nèi)對ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越明顯。與空白對照組比較，橙皮苷在50-150μg/mL范圍內(nèi)對平滑肌細(xì)胞的增殖無明顯作用。說明在此濃度范圍內(nèi)，橙皮苷對血管平滑肌細(xì)胞的生長無抑制或促進(jìn)作用，對其生長無毒性作用。但隨著橙皮苷濃度達(dá)到200μg/mL及以上時(shí)，橙皮苷對低密度脂蛋白誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞的增殖表

6、現(xiàn)出明顯的抑制作用。
　　3、橙皮苷對血管平滑肌細(xì)胞糖胺聚糖表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組比較， ox-LDL組中上清液與細(xì)胞層中GAG含量明顯升高(P＜0.01)。與ox-LDL組比較，加入濃度梯度橙皮苷各組上清液與細(xì)胞層中GAG含量都有明顯降低(P＜0.01)，且有濃度依賴性。與空白對照組比較，ox-LDL組上清液中GAG在總GAG中的比例明顯上升，說明ox-LDL可明顯促進(jìn)小鼠血管平滑肌細(xì)胞GAG的表達(dá)及代謝。與ox-L

7、DL組比較，50μg/mL橙皮苷組作用不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但100μg/mL橙皮苷組、150μg/mL橙皮苷組均可降低由ox-LDL誘導(dǎo)的小鼠血管平滑肌細(xì)胞GAG的表達(dá)及代謝。但100μg/mL橙皮苷組與150μg/mL橙皮苷組作用強(qiáng)度無顯著差異。
　　4、橙皮苷對平滑肌細(xì)胞硫酸軟骨素蛋白聚糖biglycan和decorin表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，ox-LDL組biglycan的表達(dá)量明顯升高(P＜0.01)

8、，decorin的表達(dá)顯著下降;與ox-LDL組比較，50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL橙皮苷組biglycan的表達(dá)量均有所下降(P＜0.01)，decorin的表達(dá)量有所上升(P＜0.05)。
　　5、橙皮苷對血管平滑肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，ox-LDL組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增加;與ox-LDL組比較，橙皮苷50μg/mL組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量無明顯差異，橙皮苷100μg/mL組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)明顯下降

9、，橙皮苷150μg/mL組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)也顯著降低。
　　6、橙皮苷對氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移的抑制作用。與空白對照組比較，ox-LDL能夠明顯促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移(P＜0.01)，證實(shí)了50μg/mox-LDL可以誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的遷移，細(xì)胞模型成立。加入橙皮苷進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與ox-LDL組相比，各個(gè)濃度橙皮苷組均可明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且，與橙皮苷50μg/mL

10、組比較，橙皮苷100μg/mL組和橙皮苷200μg/mL組的抑制做用要強(qiáng)。說明橙皮苷對血管平滑肌細(xì)胞的遷移抑制作用可能存在濃度依賴性。但與橙皮苷100μg/mL組比較，橙皮苷200μg/mL組抑制作用并不明顯(P＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？赡苷f明，橙皮苷對血管平滑肌細(xì)胞遷移的抑制作用濃度范圍在50μg/mL-200μg/mL，并在100μg/mL時(shí)達(dá)到較大程度，在100μg/mL-200μg/mL變化不明顯。
　　結(jié)論: