不同基因型戊型肝炎疫苗p239和p179免疫原性的差異及其機制.pdf

1、HE疫苗的免疫原性主要體現(xiàn)為疫苗免疫機體后血清中抗-HEV IgG的滴度高低。由于p239和p179兩種HE疫苗來自HEV不同基因型，尤其是它們的片段大小各不一樣，因此本論文通過間接法ELISA，分別應用等長片段的4種基因型p166作為包被抗原檢測p239和p179疫苗免疫后小鼠、人血清以及基因1型和4型HEV毒株攻擊后恒河猴血清中抗-HEVIgG，通過分析不同基因型p166抗原與血清樣本中抗HEV IgG免疫反應的差異，對不同基因型H

2、E疫苗p239和p179的免疫原性差異進行比較。另外，p166重組蛋白內(nèi)還含有同時包含在p239和p179疫苗內(nèi)的中和抗原表位，分別以基因1型和4型p166為免疫原制備鼠源單克隆抗體(McAbs)，應用間接法ELISA、Western blot、體外中和試驗以及建立競爭抑制ELISA鑒定所制備的McAbs的基因型特異性，來分析p239和p179免疫原性的基因型差異機制。旨在為安全高效HE疫苗的研制、HEV血清型分析、診斷試劑的開發(fā)提供科

3、學依據(jù)。
　　一、不同基因型戊型肝炎疫苗p239和p179的免疫原性差異
　　首先以p239和p179疫苗各免疫6只Balb/c小鼠，每只10ug，定期采集小鼠血清，用4種基因型混合抗原p166mix（p166w01、p166Mex、p166US、p166Chn等量混合）作為包被抗原，檢測抗-HEV IgG抗體，監(jiān)測抗體的變化;繼后再分別用4種基因型p166為包被抗原檢測免疫后第20周小鼠血清中抗-HEV IgG;其次采集p

4、239和p179疫苗3針免疫7個月后人血清，分別用4種基因型p166為包被抗原檢測其與各血清樣本中抗HEV-IgG。為了進一步分析天然HEV病毒顆粒是否同樣存在免疫原性的基因型差異，分別用105病毒滴度的HEV1型W01毒株和4型NJ703毒株靜脈攻擊恒河猴，定期采集猴血清，p166mix作為包被抗原檢測恒河猴血清中抗-HEV IgG抗體，監(jiān)測抗體的變化，再分別用4種基因型p166作為包被抗原，用間接ELISA檢測攻毒后第12周恒河猴血

5、清中抗-HEV IgG，研究血清中抗HEV IgG的基因型差異，以上所有檢測血清樣本均從1:2000開始倍比稀釋至1:64000。通過分析血清中抗HEV IgG的基因型差異，比較不同基因型HE疫苗的免疫原性差異。結果如下:
　　A.p166W01、p166Mex抗原與p239免疫后的小鼠血清中抗-HEV IgG的免疫反應明顯高于p166US或p166Chn，但是p239免疫后小鼠血清抗HEV-IgG在抗原p166W01和p166M

6、ex之間無顯著性差異，在抗原p166US和p166Chn之間也無顯著性差異;p166US、p166Chn與p179免疫后的小鼠血清抗HEV-IgG免疫反應明顯高于p166W01或p166Mex，而免疫反應性在抗原p166US和p166Chn之間、p166W01和p166Mex之間同樣未見明顯差異。其中83％的p239免疫小鼠血清抗HEV-IgG免疫反應結果在抗原p166W01與p166Chn相比，其抗體滴度存在2倍或2倍以上差異，83％

7、的p179免疫小鼠血清抗-HEV IgG在抗原p166W01和p166Chn之間的免疫反應顯示抗體滴度存在2倍或2倍以上差異，其中4倍或以上滴度差異的均為33.3％。
　　B.分別用等量4種基因型p166作為包被抗原檢測p179疫苗和p239疫苗Ⅰ期臨床試驗3針免疫后7個月血清中抗-HEV IgG，并比較4種基因型p166在與不同疫苗免疫后血清ELISA反應的差異，p166W01和p166Mex與p239疫苗免疫血清抗-HEV I

8、gG ELI SA反應明顯高于p166US或p166Chn，顯示出統(tǒng)計學差異，而p166W01和p166Mex對血清中的抗-HEV IgG的檢出未見顯著性差異，抗原p166US和p166Chn對血清的抗-HEV IgG的檢出結果無顯著性差異;與此相反，p179疫苗免疫血清與抗原p166US和p166Chn的反應結果明顯高于抗原p166W01或p166Mex。54％的p239疫苗和63％的p179免疫后血清在與基因1型p166抗原和基因4

9、型p166抗原之間免疫反應的抗體滴度達到2倍或2倍以上滴度差異，其中4倍或以上滴度差異分別為:p239疫苗免疫后血清為20％，p179疫苗免疫后血清為26％。
　　C.分別用等量的4種不同基因型p166檢測W01和NJ703攻毒后8周恒河猴血清中的抗-HEV IgG抗體，W01、NJ703攻毒后恒河猴血清中抗HEV IgG與不同基因型p166免疫反應結果顯示出明顯的基因型差異，即W01攻擊恒河猴血清與p166W01和p166Mex

10、的免疫反應明顯高于p166US或p166Chn，并具有統(tǒng)計學差異，NJ703攻擊恒河猴血清與p166US、p166Chn的免疫反應明顯高于p166W01或p166Mex。8份恒河猴HEV攻毒后血清在與基因1型p166抗原免疫反應性與4型p166抗原之間均存在4倍或4倍以上的滴度差異。
　　以上結果表明，基因1型HEVp239疫苗和基因4型HEV p179疫苗免疫小鼠和人血清、基因1型HEV毒株W01和基因4型HEV毒株NJ703攻

11、擊恒河猴后在血清中產(chǎn)生的抗-HEV IgG均具有明顯的基因型差異，反映出p239疫苗和p179疫苗以及天然HEV病毒顆粒均存在免疫原性的基因型差異，即基因1型HE p239疫苗和基因1型HEV病毒顆粒免疫血清中會產(chǎn)生基因1、2型特異性IgGs;而基因4型HEp179疫苗和基因4型HEV病毒顆粒免疫血清中會產(chǎn)生基因3、4型特異性IgGs。這些結果與HEV的H型和Z型分型相吻合。
　　二、戊型肝炎疫苗基因型差異的機制探討
　　以

12、上國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)的不同基因型HE疫苗p239和p179以及不同基因型HEV毒株W01和NJ703免疫原性的差異，推測其機制應該是抗原表位的差異，我們推測它們之間除了存在HEV共同抗原表位外還具有HEV基因型（1、2基因型和3、4基因型）的特異性抗原表位。免疫學中研究抗原表位最有效的工具和手段是McAbs。為此我們選擇均包含在p239疫苗和p179疫苗內(nèi)的并含有中和性抗原表位的p166為免疫原制備鼠源性McAbs。結果如下:
　　A

13、.以HEV第1基因型p166Sar（巴基斯坦株）為免疫原制備鼠源McAbs，采用間接ELISA法及免疫印跡法(Western blot)檢測McAbs與4種基因型HEV ORF2重組蛋白p166W01、p166Mex、p166US和p166Chn的交叉反應性。用獲得的McAbs細胞制備腹水，利用基于PCR的HEV體外中和試驗，檢測它們對基因1、2、3、4型人HEV的中和活性。結果如下:獲得3株穩(wěn)定分泌抗-p166McAbs的雜交瘤細胞株

14、，即3G1、4H4、2B1。其中3G1、4H4分泌的McAb與已知基因1、2、3、4型p166均結合;而2B1分泌的McAb只與1、2型p166特異結合，而不與已知基因3、4型p166結合。尤為重要的是，體外中和試驗結果顯示3G1分泌的McAb腹水可以同時中和4種基因型HEV，而2B1的McAb腹水只能中和1、2型HEV，不能中和3、4型HEV。
　　B.以HEV第4基因型p166Chn（中國株）為免疫原制備鼠源單克隆抗體(McA

15、bs)，采用間接ELISA法及免疫印跡法(Western blot)檢測McAbs與已知基因型HEV ORF2重組蛋白p166W01、p166Mex、p166US和p166Chn的交叉反應性。用獲得的McAbs細胞制備腹水，利用基于PCR的HEV體外中和試驗，檢測它們對基因1～4型HEV的中和活性。結果如下:獲得3株穩(wěn)定分泌抗-p166 McAbs的雜交瘤細胞株，即5G5、6A1、4C5。其中5G5、6A1分泌的McAb與已知基因1、2

16、、3、4型p166均結合;而4C5分泌的McAb只與3、4型p166特異結合，而不與已知基因1、2型p166結合。尤為重要的是，5G5分泌的McAb腹水同時能中和1、2、3、4型HEV，而4C5的McAbs腹水只能中和3、4型HEV，不能中和1、2型HEV。
　　C.分別將針對p166Sar的鼠源性中和性McAbs2B1、3G1，p166Chn免疫小鼠獲得的中和性McAbs4C5、5G5，進行純化以及辣根過氧化物酶標記（HRP），

17、分別用基因1型p166W01和基因4型p166Chn作為包被抗原，并通過方陣滴定確定包被抗原和酶標單抗的最佳稀釋度，建立競爭抑制ELISA，通過檢測不同單抗之間是否能夠競爭與同一抗原結合，判斷其是否作用于同一抗原表位，進一步判斷疫苗上抗原表位的異同。結果:McAb3G1與McAb5G5均不能抑制HRP-2B1與包被抗原p166W01的結合，說明McAb3G1和McAb2B1在第1基因型重組蛋白p166W01上所對應的抗原表位不同。而Mc

18、Ab3G1與McAb5G5可相互競爭與包被抗原p166W01結合，說明來源于基因1型p166的McAb3G1與來源于基因4型p166的McAb5G5作用于同一抗原表位，即第1基因型重組蛋白p166存在共同型中和抗原表位以及第1、2型特異性中和性的抗原表位。而McAb3G1、5G5與4C5之間的競爭抑制結果顯示:McAb3G1與McAb5G5不能抑制HRP-4C5與包被抗原p166Chn的結合，同樣說明p166Chn存在4種基因型共同型中

19、和抗原表位以及第3、4基因型特異性中和性抗原表位。
　　以上結果提示HEV ORF2重組蛋白p166既含有不同基因型HEV共同的中和抗原表位，也含有基因1、2型特異性、基因3、4型特異性的中和抗原表位，具有不同的抗原特征。由于HE疫苗p239和p179均含有p166抗原片段，p166抗原表位的基因型差異完全可以解釋p239和p179疫苗免疫原性的基因型差異，甚至也可以解釋不同基因型HEV毒株感染猴血清與不同基因型p166抗原反應性