清脂護(hù)肝方對(duì)Src家族相關(guān)激酶Hck在非酒精性脂肪性肝病中的作用機(jī)制探討.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種以無(wú)過(guò)量飲酒史和其他明確肝損害因素引起的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的脂肪變性、壞死以及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和脂肪積貯等為特征的臨床病理綜合癥。非酒精性脂肪肝炎(Non-alcohlic Steatohepatitis，NASH)是指肝細(xì)胞脂肪變性、小葉和/或匯管區(qū)炎癥，有時(shí)伴有肝纖維化和Mallory小體形成的一種病理狀態(tài)，在NAFLD中占30％～50％，

2、這是造成非酒精性脂肪性肝硬化、肝癌等并發(fā)癥的重要環(huán)節(jié)，阻斷這一環(huán)節(jié)就能夠改變NAFLD的預(yù)后，因此探討清脂護(hù)肝方在NASH中的作用及其機(jī)制可為臨床治療NAFLD提供一定的理論依據(jù)。
　　通過(guò)觀察清脂護(hù)肝方對(duì)NASH大鼠肝功能、血脂、炎癥因子(IL-1、IL-6、TNF-α)以及NASH大鼠肝組織和kupffer細(xì)胞中Src家族相關(guān)激酶Hck表達(dá)的影響，探討清脂護(hù)肝方在NASH中的作用及其機(jī)制。
　　人體水平研究:選取2012

3、-2014年南通市第三人民醫(yī)院病理科經(jīng)診斷為NAFLD的肝組織蠟塊12例，以及正常肝組織10例，用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)方法檢測(cè)Src家族相關(guān)激酶Hck的表達(dá)水平。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):qRT-PCR:培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的kupffer細(xì)胞，采用Trizol一步法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用q RT-PCR方法檢測(cè)Src家族相關(guān)激酶Hck的mRNA的表達(dá)情況;培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的kupffer細(xì)胞，用60％

4、濃度CCL4損傷液刺激4h[2]后用20％清脂護(hù)肝方藥物血清（前期實(shí)驗(yàn)研究表明:清脂護(hù)肝方藥物血清添加量為20％時(shí)，增值實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)最高，效果最好），并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用qRT-PCR方法檢測(cè)藥物干預(yù)前后Src家族相關(guān)激酶Hck mRNA的表達(dá)情況;免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry，ICC):對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的kupffer細(xì)胞，用60％濃度CCL4損傷液刺激4h后分別用20％清脂護(hù)肝方藥物血清繼續(xù)培養(yǎng)48h，用ICC

5、的方法檢測(cè)Src家族相關(guān)激酶Hck的表達(dá)水平;蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot):收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的kupffer細(xì)胞，提取蛋白，采用Western Blot的方法檢測(cè)Src家族相關(guān)激酶Hck的mRNA的表達(dá)情況。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):選用2月齡雄性SD大鼠喂養(yǎng)高脂飼料制備成NASH模型，將造模成功的大鼠再隨機(jī)分為模型組、低劑量清脂護(hù)肝方組、中劑量清脂護(hù)肝方組和高劑量清脂護(hù)肝方組，模型組予0.9％NaCl溶液灌胃;清脂護(hù)肝方組分別以2.4

6、3g/kg/d，12.15g/kg/d，24.3g/kg/d灌胃6周;對(duì)照組注射等體積生理鹽水。觀察記錄大鼠的行為表現(xiàn)及體質(zhì)量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死實(shí)驗(yàn)大鼠，采用OLYMPUS全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑檢測(cè)肝功能及血脂;并對(duì)肝組織病理切片采用蘇木精-伊紅染色觀察大鼠脂肪變性及炎癥程度;IHC法檢測(cè)NASH大鼠肝組織中Src家族相關(guān)激酶Hck的表達(dá)水平;ELISA法檢測(cè)血清中NASH炎癥因子（IL-1、IL-6、TNF-α）的表達(dá)情況。<

7、br>　　人體水平研究:IHC結(jié)果表明:Hck在人體正常肝組織中低表達(dá)，炎癥組織中表達(dá)增高，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);細(xì)胞實(shí)驗(yàn):q RT-PCR:Hck的mRNA在Kuffer細(xì)胞中的表達(dá)豐度滿足敲減實(shí)驗(yàn)要求，用60％CCL4損傷液刺激后Hck的mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05);用清脂護(hù)肝方藥物血清干預(yù)后:Hck的mRNA表達(dá)降低，且呈劑量依賴性。ICC:Hck在kupffer細(xì)胞中有表達(dá)，呈棕黃色顆粒，并與炎癥程度呈正

8、相關(guān)，藥物血清培養(yǎng)后表達(dá)減少，棕黃色顆粒明顯變錢(qián)、變少，呈散在分布;Western Blot:Hck在鼠kupffer細(xì)胞中表達(dá)明顯。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):IHC結(jié)果表明:Hck在正常肝臟組織kupffer細(xì)胞低表達(dá)，炎癥刺激時(shí)高表達(dá)，且與炎癥反應(yīng)呈極高正相關(guān);用清脂護(hù)肝方對(duì)NASH大鼠進(jìn)行干預(yù)治療后，我們發(fā)現(xiàn)用藥組無(wú)論是低、中、高劑量組，在抑制Src相關(guān)激酶成員Hck的陽(yáng)性表達(dá)時(shí)有顯著效果，特別是高劑量組，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)

9、; ELISA:與正常組比較，模型組NASH炎癥因子IL-1、IL-6表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，TNF-α表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較，中、高劑量組IL-1、IL-6表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，尤以高劑量組明顯，TNF-α表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　Hck在正常肝臟組織kupffer細(xì)胞中低表達(dá)，炎癥刺激時(shí)高表達(dá)，且與炎癥反應(yīng)呈極高正相關(guān);用清脂護(hù)肝方對(duì)NASH大鼠進(jìn)行干預(yù)治療后