從造血干細(xì)胞增殖及造血微環(huán)境探討中藥治療β地中海貧血的分子機(jī)制.pdf

1、β地中海貧血（簡(jiǎn)稱β地貧），屬于常染色體隱性遺傳血紅蛋白病。地貧發(fā)病機(jī)制明確，但對(duì)其治療相對(duì)滯后。導(dǎo)師吳志奎教授基于“腎生髓、髓生血”理論，用“補(bǔ)腎益髓”法在地貧高發(fā)區(qū)治療β地貧取得了肯定療效。
　　本論文的主要內(nèi)容是在深入學(xué)習(xí)傳承導(dǎo)師“補(bǔ)腎益髓”治療地貧理論和臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)前期工作的基礎(chǔ)上，首次在高發(fā)區(qū)開展“補(bǔ)腎益髓”治療β地貧隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照規(guī)范臨床研究并對(duì)其療效的可能機(jī)制提出研究假說，認(rèn)為“補(bǔ)腎益髓”治療地貧發(fā)揮療

2、效的可能機(jī)制是通過改善造血微環(huán)境，調(diào)控骨髓造血干細(xì)胞增殖分化、影響DNA甲基化表觀遺傳修飾，進(jìn)而促進(jìn)骨髓有效造血實(shí)現(xiàn)的。通過分離培養(yǎng)骨髓造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞，采用RT-PCR檢測(cè)珠蛋白基因表達(dá)調(diào)控，利用Western blot，DNA甲基化芯片，透射電鏡等現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，驗(yàn)證假說的客觀性。
　　研究目標(biāo)：
　　開展補(bǔ)腎益髓治療β地貧臨床規(guī)范研究;并從改善造血微環(huán)境，調(diào)控骨髓造血干細(xì)胞增殖分化，影響D

3、NA甲基化修飾等方面對(duì)其促進(jìn)骨髓有效造血的療效機(jī)制進(jìn)行深入研究，側(cè)面揭示“腎生髓、髓生血”的理論內(nèi)涵。
　　本項(xiàng)課題圍繞著研究目標(biāo)從臨床和實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分展開研究。
　　1.補(bǔ)腎益髓治療地貧的臨床研究
　　1.1 地貧患者中醫(yī)證候分布規(guī)律調(diào)查
　　調(diào)查中醫(yī)腎虛證候（腎精虧虛證、腎陰虛證、腎陽虛證）在地貧患者中的具體分布，中醫(yī)腎虛癥候積分與基因型的關(guān)系以及在地貧患者中的差異，為益髓生血顆粒臨床辨證治療地貧提供依據(jù)。

4、r>　　1.2 益髓生血顆粒治療β地貧臨床規(guī)范研究
　　采用隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)（隨機(jī)雙盲安慰劑平行對(duì)照），臨床試驗(yàn)前在國(guó)際臨床研究注冊(cè)網(wǎng)站進(jìn)行注冊(cè)。對(duì)治療前后患者的中醫(yī)癥候量化評(píng)分，連續(xù)觀察血液指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化，以國(guó)際公認(rèn)的診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)，采用第三方統(tǒng)計(jì)分析對(duì)治療結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　2.補(bǔ)腎益髓治療地貧的機(jī)制研究
　　主要圍繞著益髓生血顆粒治療地貧改善骨髓造血微環(huán)境，調(diào)控骨髓造血干細(xì)胞增殖分化以及影響DNA甲基化表觀遺傳修飾，進(jìn)

5、而促進(jìn)骨髓有效造血展開。
　　研究方法及結(jié)果：
　　1.臨床研究方法及結(jié)果
　　1.1 地貧患者中醫(yī)證候分布規(guī)律調(diào)查
　　地貧患者中醫(yī)證候調(diào)查結(jié)果顯示，在調(diào)查的所有患者中，以腎陰虛證195例最為多見，其次為腎精虧虛證89例，腎陽虛證所占比例較少。涉及的26項(xiàng)中醫(yī)腎虛癥侯出現(xiàn)的頻率以面色萎黃、盜汗、口唇淡白、神疲乏力、咽干、口干多見，地貧患者陰血虧虛見面色萎黃、口唇淡白;血虛則氣弱，神疲乏力;陰虛則見盜汗、口干、咽

6、干。β地貧患者基因型為純合子或雜合子的腎虛癥候積分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　1.2 益髓生血顆粒治療β地貧高發(fā)區(qū)臨床規(guī)范研究
　　采用隨機(jī)、雙盲、安慰劑平行對(duì)照方法，對(duì)患者中醫(yī)癥候量化評(píng)分，動(dòng)態(tài)觀察臨床血液指標(biāo)變化，由第三方編盲與第三方統(tǒng)計(jì)，以國(guó)際公認(rèn)的診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)臨床治療結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。入組40例β地貧患者，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組給予益髓生血顆粒，對(duì)照組給予安慰劑，療程12周。
　　益髓生血顆粒治療β地貧結(jié)果顯

7、示，治療第4周、8周、12周實(shí)驗(yàn)組有效率分別為47.06％，47.06％和58.82％;對(duì)照組有效率分別為11.11％，5.56％，5.56％;兩組有效率比較，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有效率比較均有顯著的統(tǒng)計(jì)差異（4周p＜0.05，8周p＜0.01，12周p＜0.01）。該研究在國(guó)內(nèi)外β地貧臨床研究中為首次完成。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究方法及結(jié)果
　　2.1 益髓生血顆粒治療地貧對(duì)患者骨髓造血干細(xì)胞增殖的影響
　　(1)研究

8、顯示，5例患者療后骨髓CD34+細(xì)胞體外培養(yǎng)自第2日開始，增殖較快，至第7日療后CD34+細(xì)胞增殖OD值為0.62，較療前骨髓CD34+細(xì)胞增殖明顯提高(p＜0.01)。提示益髓生血顆粒治療地貧可顯著促進(jìn)患者內(nèi)源性骨髓CD34+細(xì)胞增殖。
　　(2)研究還對(duì)不同類型（α型，β型）的兩對(duì)雙胞胎地貧患兒，進(jìn)行了遺傳背景與臨床療效、骨髓CD34+細(xì)胞的增殖能力關(guān)系的比較分析。
　　1)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同卵雙生β地貧患兒（基因型β41-4

9、2/β-28）與異卵雙生α地貧患兒(基因型——SEA/αCSα，——SEA/α4.2α)，遺傳背景不同其臨床療效及骨髓CD34+細(xì)胞的增殖能力有明顯差異。α型地貧雙胞胎患兒較β型地貧雙胞胎患兒臨床貧血癥狀輕，經(jīng)益髓生血顆粒治療后，療效優(yōu)于β地貧雙胞胎患兒;α地貧雙胞胎患兒骨髓CD34+細(xì)胞的增殖能力高于β型地貧雙胞胎患兒。
　　2)β地貧遺傳背景完全相同(基因型β41-42/β-28)，骨髓CD34+細(xì)胞體外增殖情況個(gè)體差異較大，

10、在臨床貧血較輕的患者，其骨髓CD34+細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng)。α地貧患兒療后骨髓CD34+細(xì)胞增殖能力隨時(shí)間變化提高明顯，基因型—-SEA/αCSα（缺失、突變）患兒骨髓CD34+細(xì)胞增殖能力較基因型——SEA/α4.2α(缺失型)患兒更為明顯。上述研究結(jié)果在中藥治療地貧研究中為首次完成。
　　2.2 益髓生血顆粒含藥血清誘導(dǎo)紅系分化研究
　　研究通過半固體集落培養(yǎng)方法，觀察益髓生血顆粒含藥血清高、中、低各濃度對(duì)骨髓CD34+細(xì)

11、胞分化集落的影響;同時(shí)以K562細(xì)胞為研究對(duì)象，用益髓生血顆粒含藥血清培養(yǎng)K562細(xì)胞，采用聯(lián)苯胺染色和RT-PCR技術(shù)觀察益髓生血顆粒誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化的作用。
　　結(jié)果顯示益髓生血顆粒含藥血清作用第13天，BFU-E集落數(shù)量與對(duì)照組比較，高劑量組呈現(xiàn)明顯的促進(jìn)集落分化的作用(p＜0.001);低劑量組與中劑量組集落數(shù)高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)意義(p＞0.05)。益髓生血顆粒高劑量含藥血清能夠促進(jìn)K562細(xì)胞α和γ珠蛋白

12、基因表達(dá)(p＜0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　1.臨床研究
　　1.1 α地貧和β地貧臨床均存在腎虛表現(xiàn)，以腎陰虛證最為多見，基本證型為腎精血不足、腎陰虛證。
　　1.2 隨機(jī)、雙盲、安慰劑平行對(duì)照評(píng)價(jià)益髓生血顆粒治療地貧療效，療程結(jié)束，實(shí)驗(yàn)組地貧患者治療4周、8周、12周有效率分別為47.06％，47.06％和58.82％;對(duì)照組有效率分別為11.11％，5.56％，5.56％;兩組各時(shí)間節(jié)點(diǎn)有效率差異有統(tǒng)計(jì)

13、學(xué)意義（第4周p＜0.05，第8周p＜0.01，第12周p＜0.01）。該研究在國(guó)內(nèi)外β地貧臨床研究中為首次完成。
　　2.療效機(jī)制研究
　　2.1 益髓生血顆粒能夠促進(jìn)骨髓CD34+細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)骨髓有效造血:
　　(1)益髓生血顆粒能夠促進(jìn)地貧患者內(nèi)源性骨髓CD34+細(xì)胞體外增殖。地貧患者骨髓CD34+細(xì)胞的增殖具有時(shí)間依賴性，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，療后骨髓CD34+細(xì)胞增殖能力顯著提高。
　　(2)遺傳背

14、景與臨床療效、骨髓CD34+細(xì)胞的增殖能力關(guān)系的比較，遺傳背景不同的兩對(duì)雙胞胎地貧患兒，其臨床療效及骨髓CD34+細(xì)胞的增殖能力有明顯差異;同類型雙胞胎患兒，同卵雙生β地貧患兒（基因型β41-42/β-28）療效有個(gè)體差異，對(duì)異卵雙生α地貧患兒（基因型——SEA/αCSα，——SEA/α4.2α）基因型不相同療效也有明顯差異。
　　(3)益髓生血顆粒含藥血清高劑量組促進(jìn)骨髓CD34+細(xì)胞分化紅系集落形成，并能誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系

15、分化。
　　(4)益髓生血顆粒組分大黃素能夠促進(jìn)骨髓CD34+細(xì)胞分化集落細(xì)胞γ珠蛋白基因表達(dá)。
　　2.2 益髓生血顆粒能夠改善骨髓造血微環(huán)境，促進(jìn)骨髓有效造血:
　　(1)益髓生血顆粒能夠提高患者骨髓血血漿SCF、IL-6、G-CSF、EPO造血細(xì)胞因子含量，提高患者骨髓內(nèi)紅細(xì)胞SOD，GSH-PX酶活性。
　　(2)組分單體大黃素能夠促進(jìn)骨髓MSC細(xì)胞增殖。
　　(3)大黃素能夠提高骨髓MSC細(xì)胞分泌

16、細(xì)胞因子SCF的活性。
　　(4)益髓生血顆粒治療β地貧有效病例全基因組DNA甲基化結(jié)果顯示，兩個(gè)關(guān)鍵基因JAK3和MAPK10可能在細(xì)胞因子誘導(dǎo)干細(xì)胞分化過程中起作用。
　　益髓生血顆粒能夠改善骨髓造血微環(huán)境，調(diào)控骨髓造血干細(xì)胞有效造血，表現(xiàn)為能夠促進(jìn)骨髓MSC細(xì)胞自分泌細(xì)胞因子，減少早期紅系集落細(xì)胞氧化損傷，促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞增殖，促進(jìn)造血干細(xì)胞早期分化集落細(xì)胞γ珠蛋白的基因表達(dá)，促進(jìn)有效造血。益髓生血顆粒緩解地貧患者臨

17、床貧血癥狀的作用機(jī)制可能是促進(jìn)骨髓有效造血，減少骨髓內(nèi)早期紅細(xì)胞的溶血。
　　研究結(jié)果提示，“腎生髓、髓生血”理論的現(xiàn)代生物學(xué)內(nèi)涵可部分體現(xiàn)為骨髓微環(huán)境調(diào)控下的骨髓造血干細(xì)胞的增殖分化功能。
　　論文創(chuàng)新之處：
　　1.本研究首次在高發(fā)區(qū)完成益髓生血顆粒治療β地貧的隨機(jī)、雙盲、安慰劑平行對(duì)照臨床試驗(yàn)，進(jìn)行臨床研究國(guó)際注冊(cè)，第三方編盲統(tǒng)計(jì)，以國(guó)際公認(rèn)的診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)益髓生血顆粒治療地貧進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，在國(guó)內(nèi)外β地貧臨床

18、研究中屬于首次完成。
　　2.研究發(fā)現(xiàn)益髓生血顆粒能夠促進(jìn)地貧患者內(nèi)源性骨髓CD34+細(xì)胞體外增殖。對(duì)雙胞胎患兒研究發(fā)現(xiàn)，遺傳背景與療效、患兒骨髓CD4+細(xì)胞增殖密切相關(guān)，上述研究在中藥治療地貧療效機(jī)制研究中為首次完成。
　　3.理論創(chuàng)新:論文基于補(bǔ)腎益髓治療β地貧的明顯療效，從促進(jìn)患者內(nèi)源性造血干細(xì)胞增殖分化，改善造血微環(huán)境，誘導(dǎo)紅系分化及影響DNA甲基化表觀遺傳修飾層面，探討了補(bǔ)腎益髓治療β地貧療效的分子機(jī)制，從一個(gè)側(cè)面