放射致鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生自噬過程PARP-1與LKB1-AMPK-mTOR通路關(guān)系及干擾該通路對(duì)放射抗拒性的影響.pdf

1、【研究背景】
　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種好發(fā)于我國(guó)長(zhǎng)江以南包括廣東、廣西、湖南、福建、浙江、香港及東南亞地區(qū)的惡性上皮細(xì)胞腫瘤。由于其特殊的解剖位置，無論是早期還是局部晚期，放療是其主要治療方式。雖然經(jīng)過規(guī)范治療，使用調(diào)強(qiáng)放療為主，聯(lián)合誘導(dǎo)、同期、輔助化療及靶向藥物等增敏治療，臨床上仍有大約20％的鼻咽癌患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其主要原因歸為放射抗拒。因此，研究鼻咽癌放射抗拒相

2、關(guān)基礎(chǔ)研究，為鼻咽癌的增敏治療提供新的依據(jù)。
　　自噬作為鼻咽癌放射抗拒的重要原因之一。本課題組前期研究表明：鼻咽癌CNE-2細(xì)胞在照射后發(fā)生自噬及凋亡,且該自噬在放射致CNE-2細(xì)胞凋亡過程中起到促存活功能；放射可以誘導(dǎo)多聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(Poly ADP-ribose polymerase1，PARP-1)激活并且誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，PARP-1在自噬的上游；在鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的裸鼠移植瘤中，沉默自噬基因，能增加其放

3、射敏感性。
　　近年來研究表明，LKB1蛋白（liver kinase B1）-單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR)（LKB1-AMPK-mTOR）信號(hào)通路可能是自噬發(fā)生在重要通路，因此，在前期研究基礎(chǔ)上，本研究繼續(xù)探討放射致鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生自

4、噬過程PARP-1與LKB1-AMPK-mTOR信號(hào)通路關(guān)系，并深入探討干擾PARP-1、LKB1-AMPK-mTOR信號(hào)通路降低自噬活性對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射抗拒性的影響。
　　研究?jī)?nèi)容：
　　第一部分放射致鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生自噬過程PARP-1與LKB1-AMPK-mTOR信號(hào)通路關(guān)系的探討
　　【目的】探明在放射引起鼻咽癌CNE-2細(xì)胞自噬過程中，PARP-1是否是LKB1-AMPK-mTOR信號(hào)通路的上游信號(hào)調(diào)控點(diǎn)。①證

5、明是PARP-1通過激活LKB1和AMPK，最終激活自噬；②確定AMPK的抑制不會(huì)影響PARP-1的激活。
　　【方法】
　　1.利用Western blot（Wb）技術(shù)檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ，證明鼻咽癌細(xì)胞放射后發(fā)生自噬。
　　2.利用Wb技術(shù)檢測(cè)放射致CNE-2細(xì)胞發(fā)生自噬過程中對(duì)PARP-1蛋白，LKB1蛋白、AMPK蛋白及mTOR下游P70S6K蛋白磷酸化狀態(tài)（p-LKB1、p-AMPK及p-P70S6K）的

6、影響；利用化學(xué)激活劑（5-Aminoimidazole-4-carboxamide1-β-D-ribofuranoside,AICAR)激活A(yù)MPK，慢病毒介導(dǎo)的PARP-1基因沉默抑制PARP-1和化學(xué)抑制劑（Compound C）抑制AMPK后，檢測(cè)PARP-1、p-LKB1、p-AMPK、p-P70S6K及LC3-Ⅱ的表達(dá)變化。
　　【結(jié)果】
　　1.鼻咽癌細(xì)胞放射后自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ增加。
　　2.鼻咽癌細(xì)胞

7、放射后PARP-1、p-AMPK、LC3-Ⅱ較對(duì)照組表達(dá)增加，p-P70S6K減少。
　　3.AICAR激活A(yù)MPK，PARP-1表達(dá)不變，p-AMPK增多，p-P70S6K減少，LC3-Ⅱ增多。
　　4.慢病毒介導(dǎo)的PARP-1基因沉默后，PARP-1、p-AMPK表達(dá)減少，p-P70S6K增多，LC3-Ⅱ減少。
　　5.抑制AMPK，PARP-1表達(dá)不變，p-AMPK減少，p-P70S6K增加，LC3-Ⅱ減少，以上

8、各組結(jié)果比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05)。
　　6.p-LKB1在各組中的表達(dá)量沒有明顯變化，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，而加入AMPK抑制劑Compound C后發(fā)現(xiàn)p-LKB1無表達(dá)。
　　【結(jié)論】
　　鼻咽癌細(xì)胞放射后發(fā)生自噬，在放射引起CNE-2細(xì)胞自噬過程中，PARP-1是AMPK-mTOR信號(hào)通路的上游信號(hào)調(diào)控點(diǎn)。
　　第二部分干擾PARP-1-AMPK-mTOR通路對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞放

9、射敏感性的影響
　　【目的】探討人為干擾PARP-1-AMPK-mTOR通路下調(diào)自噬后鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的放射線敏感性變化。
　　【方法】
　　1.在不照射線和照射線情況下，分別利用慢病毒介導(dǎo)的PARP-1基因沉默抑制PARP-1、Compound C抑制AMPK后，采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE-2細(xì)胞的增殖情況。
　　2.在不照射線和照射線情況下，分別利用慢病毒介導(dǎo)的PARP-1基因沉默抑制PARP-1、Comp

10、ound C抑制AMPK后，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE-2細(xì)胞的增殖情況。
　　【結(jié)果】
　　1.MTT結(jié)果提示在第1-5天、不照射線情況下，PARP-1基因沉默組增殖與對(duì)照組比較無明顯差別，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，Compound C組比對(duì)照組增殖減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；照射線情況下，PARP-1基因沉默組、Compound C組比對(duì)照組增值減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05)；照射線下加入Co

11、mpound C組比不照射線加入Compound C組增殖減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05)。
　　2.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在不照射線情況下，PARP-1基因組沉默組克隆形成數(shù)與對(duì)照組比較無明顯差別(p>0.05)，Compound C組與對(duì)照組比較克隆數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；照射線情況下，PARP-1基因沉默組、Compound C組克隆形成數(shù)比對(duì)照組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05)。照射線下加入Co