RAGE阻斷劑FPS-ZM1對晚期糖基化終末產(chǎn)物所致大鼠腦損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、研究目的：
　　建立晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)損傷動物模型，研究AGEs-RAGE對認知功能、tau蛋白磷酸化、氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)指標的影響;進一步探討FPS-ZM1對AGEs誘導腦損傷的保護作用及其機制。
　　研究方法：
　　1.AGEs損傷大鼠模型的建立及分組
　　6-8周齡清潔級健康雄性Wistar大鼠，隨機分為4組，正常對照組(Control)，F(xiàn)PS-ZM1對照組(FZM1)，AGEs模型組(

2、AGEs)，AGEs+FPS-ZM1干預組(AGEs+FZM1)，每組10只。腦立體定位注射的方法造模，AGEs和AGEs+FZM1組雙側(cè)海馬注射AGE-BSA5μl，Control和FZM1組注射同等量的生理鹽水。造模前1周開始，F(xiàn)ZM1和AGEs+FZM1組每天腹腔注射FPS-ZM1(1mg/kg/d，2ml)共4周，Control和AGEs組每天腹腔注射2ml生理鹽水共4周。
　　2.行為學檢測:Morris水迷宮實驗用于評

3、估各組大鼠的學習和記憶能力。
　　3.Western blot和免疫組化檢測海馬RAGE蛋白的表達。
　　4.Western blot檢測海馬tau蛋白磷酸化水平，Tau-5（總tau），PHF-1(Phospho-tauat Ser396/404), PT231(Phospho-tau at Thr231)。
　　5.Western blot檢測海馬Akt和GSK-3磷酸化水平，t-Akt(total Akt)，Se

4、r473-Akt(Phospho-Akt at Ser473),tGSK-3β(total GSK-3),S9-GSK3β(Phospho-GSK-3β atSer9)。
　　6.組織活性氧熒光定量(DCFH-DA)法檢測各組大鼠海馬區(qū)活性氧(ROS)水平;丙二醛(MDA)法檢測海馬脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation，LPO)水平;生化方法檢測各組大鼠海馬超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽過氧化物

5、酶(GPx)的活性或含量。
　　7.Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)指標GRP78，p-PERK，p-eIF2α，CHOP，caspase-12。
　　8.分光光度法測定細胞凋亡相關(guān)蛋白酶caspase-3，caspase-9的活性。
　　研究結(jié)果：
　　1.Morris水迷宮成績比較
　　Morris水迷宮實驗第3天開始，AGEs組大鼠逃避潛伏期較Control組明顯延長(P＜0.05)，與AG

6、Es組對比，AGEs+FZM1組逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05）。AGEs組大鼠穿越平臺所在位置的次數(shù)和在目標象限的時間較Control組顯著減少(P＜0.01，P＜0.01)，AGEs+FZMl組大鼠穿越平臺的次數(shù)和在目標象限的時間較AGEs組明顯增加（P＜0.01，P＜0.01）。四組動物的游泳速度無顯著差異。
　　2.各組大鼠海馬組織RAGE蛋白表達比較
　　Western blot顯示，AGEs組大鼠腦組織RAGE

7、蛋白表達明顯高于Control組（P＜0.01），AGEs+FZM1組大鼠腦組織RAGE蛋白表達較AGEs組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Control組和FZM1組之間無明顯差異（P＞0.05）。
　　免疫組化顯示，Control組和FZM1組RAGE少量表達，AGEs組RAGE蛋白表達明顯高于Control組，著色呈棕黃色，陽性細胞數(shù)多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），AGEs+FZM1組大鼠腦組織RAGE表達較A

8、GEs組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3.各組大鼠海馬組織磷酸化tau蛋白，Akt，GSK3β表達的比較
　　AGEs組大鼠腦組織PHF-1，PT231蛋白表達相對系數(shù)分別為0.87和0.79，是Control組蛋白表達相對系數(shù)(0.39，0.27)的2.2倍和2.9倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.01），AGEs+FZM1組大鼠PHF-1，PT231蛋白表達相對系數(shù)(0.38，0.41)較AGE

9、s組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.01）。
　　AGEs組大鼠腦組織Ser473-Akt和S9-GSK3β蛋白表達相對系數(shù)為0.36和0.40，較Control組(0.72，0.76)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.01），給予FPS-ZM1干預后，AGEs+FZM1組腦組織Ser473-Akt和S9-GSK3β蛋白表達相對系數(shù)為0.55和0.61，與AGEs組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，

10、P＜0.01），各組大鼠腦組織t-Akt和tGSK-3β蛋白表達無差異(P＞0.05)。
　　4.各組大鼠海馬組織氧化應激及抗氧化能力的比較
　　本實驗以ROS、LPO水平評價海馬氧化損傷的程度。AGEs組大鼠腦組織ROS和LPO水平較Control組明顯升高(P＜0.01，P＜0.01)，AGEs+FZM1組大鼠腦組織ROS和LPO水平較AGEs組降低(P＜0.01，P＜0.05)，AGEs+FZM1組大鼠腦組織ROS和L

11、PO水平仍高于Control組，Control組和FZM1組之間無明顯差異（P＞0.05）。
　　SOD、GPx活性以及GSH含量可間接反映體內(nèi)清除自由基的能力。AGEs組大鼠腦組織SOD和GPx活性較Control組明顯降低（P＜0.01，P＜0.01），AGEs+FZM1組大鼠腦組織SOD和GPx活性較AGEs組升高（P＜0.01，P＜0.01），AGEs+FZM1組大鼠腦組織SOD和GPx活性仍低于Control組，Cont

12、rol組和FZM1組之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　AGEs組大鼠腦組織GSH含量較Control組明顯降低（P＜0.01），AGEs+FZM1組大鼠腦組織GSH含量較AGEs組升高(P＜0.05)，Control組和FZM1組之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　5.各組大鼠海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及凋亡相關(guān)因子的比較
　　AGEs組大鼠腦組織GRP78，p-PERK，p-eIF2α蛋白表達相對系數(shù)為(0.66，0.69

13、，0.71)，是Control組1.9，2.1和1.8倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），AGEs+FZM1組腦組織GRP78，p-PERK，p-eIF2α蛋白表達相對系數(shù)為(0.44，0.35，0.52)，較AGEs組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)，AGEs+FZM1組蛋白表達仍高于Control組，Control組和FZM1組之間無明顯差異（P＞0.05）。
　

14、　AGEs組大鼠腦組織CHOP和caspase-12蛋白表達相對系數(shù)為0.80和0.74，是Control組(0.38，0.34)的2.1和2.2倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.01），AGEs+FZM1組腦組織CHOP和caspase-12蛋白表達相對系數(shù)為0.59和0.42，較AGEs組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。Control組和FZM1組之間無明顯差異（P＞0.05）。
　　AGEs組

15、大鼠腦組織caspase-3和caspase-9活性分別是Control組的2.6和1.7倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，P＜0.01)，AGEs+FZM1組腦組織caspase-3和caspase-9活性較AGEs組降分別降低46％和29％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，P＜0.01)。Control組和FZM1組之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　1.AGEs海馬注射導致大鼠學習記憶能力下降，F(xiàn)P

16、S-ZM1通過阻斷RAGE，能夠減輕AGEs誘導的神經(jīng)損傷，改善認知功能。
　　2.AGEs-RAGE導致tau蛋白在多個AD相關(guān)位點的異常過度磷酸化，Akt/GSK-3β通路可能參與其中，F(xiàn)PS-ZM1能夠阻斷RAGE，降低GSK-3β的活性和tau蛋白異常磷酸化的水平。
　　3.AGEs與RAGE結(jié)合激活氧化應激參與腦損害，F(xiàn)PS-ZM1增強腦組織的抗氧化能力，阻斷AGEs-RAGE介導的氧化應激，是其發(fā)揮腦保護作用的內(nèi)

17、在機制之一。
　　4.AGEs與RAGE結(jié)合能夠引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，分子伴侶GRP78及信號通路相關(guān)蛋白p-PERK和p-eIF2α表達增高，凋亡相關(guān)因子CHOP和caspase-12活化。FPS-ZM1具有腦保護作用，通過阻斷RAGE，下調(diào)GRP78、p-PERK、p-eIF2α和凋亡相關(guān)因子的表達，有效阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。
　　研究意義：
　　RAGE通過多種途徑促進阿爾茨海默病(AD)的發(fā)生發(fā)展，降低RAGE的表達水

18、平或者競爭性阻斷RAGE與配體的相互作用可望成為延緩AD的治療靶點。
　　1.建立AGEs損傷模型，觀察其對tau蛋白磷酸化、氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)指標的影響，進一步證明AGEs-RAGE通路在AD發(fā)病過程中的作用。
　　2.探討FPS-ZM1阻斷RAGE與AGEs結(jié)合的腦保護作用，發(fā)現(xiàn)該藥物對AGEs誘導的tau蛋白磷酸化、氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的相關(guān)指標有明顯的改善作用，提示FPS-ZM1是一種有效的小分子RAGE阻斷劑