丙酸睪酮對(duì)線粒體電子傳遞鏈功能障礙的腦區(qū)特異性改善及其機(jī)制.pdf

1、青少年群體酗酒和人口老齡化已成為兩大社會(huì)問(wèn)題。防止酗酒造成的損害以及延緩衰老已成為目前人們關(guān)注的焦點(diǎn)。青少年酗酒男性比例明顯多于女性，酗酒者女性比男性對(duì)腦的損害幅度更大，暗示睪酮水平的變化與之密切相關(guān)。腦是酒精作用的主要靶器官之一，氧化應(yīng)激損害參與了酗酒導(dǎo)致的腦結(jié)構(gòu)和功能的改變。衰老是神經(jīng)退行性疾病的危險(xiǎn)因素，與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，如帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，多發(fā)于老年男性；睪酮低下的男性增加了阿爾

2、茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；而老年男性血清睪酮水平顯著降低，提示睪酮在神經(jīng)退行性疾病中的潛在作用。既往研究發(fā)現(xiàn)衰老與氧化還原失衡而致的線粒體氧化應(yīng)激損害有關(guān)，老年雄激素水平的降低與衰老過(guò)程中線粒體功能障礙很可能存在著密切的聯(lián)系。
　　線粒體是雙膜性細(xì)胞器，由線粒體內(nèi)膜包繞的線粒體基質(zhì)，含有完成三羧酸循環(huán)及參與氧化還原反應(yīng)的成份；線粒體內(nèi)外膜之間為膜間腔，含有高濃度的質(zhì)子，是保持線粒體膜電位的

3、必要條件。電子傳遞鏈(Electron transport chain，ETC)包括四個(gè)線粒體復(fù)合物(I、II、III、IV)，定位于線粒體內(nèi)膜，是電子傳遞和ATP生成的分子結(jié)構(gòu)。與其它細(xì)胞器不同，線粒體含有自己的DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)，其中包括mtDNA編碼的線粒體復(fù)合物I的7個(gè)亞基(ND1、2、3、4、4L、5和6)、線粒體復(fù)合物III的1個(gè)亞基、線粒體復(fù)合物IV的3個(gè)亞基以及線粒體復(fù)合物V的2個(gè)亞

4、基。線粒體對(duì)保障哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是神經(jīng)元的正常功能活動(dòng)至關(guān)重要。線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異?？梢詫?dǎo)致衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。線粒體是活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的主要來(lái)源，也是ROS損傷的主要靶目標(biāo)。在線粒體功能減弱時(shí)，ROS產(chǎn)生增多，細(xì)胞氧化-還原平衡能力降低及氧化應(yīng)激損害增加。
　　因此，本研究通過(guò)①建立丙酸睪酮(Testosterone propionate, TP)酒精處理去勢(shì)大鼠模型，

5、觀察氧化應(yīng)激損害的影響；②建立TP處理老年大鼠模型，觀察線粒體功能障礙的影響；③建立TP處理去勢(shì)大鼠模型，檢測(cè)線粒體功能的改變。探討雄激素在線粒體功能障礙中的作用。
　　第一部分丙酸睪酮在酒精處理大鼠氧化應(yīng)激損傷中的參與
　　目的：觀察去勢(shì)酒精大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激參數(shù)的改變，補(bǔ)充丙酸睪酮是否能夠改善氧化應(yīng)激參數(shù)的改變。
　　方法：①選用成年雄性SD大鼠，建立不同劑量TP處理去勢(shì)大鼠模型，確定TP改善去勢(shì)大鼠相關(guān)行為和氧化應(yīng)

6、激參數(shù)的最佳劑量，動(dòng)物分組包括正常組(Intact)、假手術(shù)組(Sham)、去勢(shì)組(GDX)和GDX-TP組(0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5及3mg/kg)；②以TP最佳劑量處理酗酒去勢(shì)大鼠，動(dòng)物包括Intact、Sham、GDX、GDX-TP、去勢(shì)酒精組(GDX-eth)、GDX-TP-eth和正常酒精組(Intact-eth)，利用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和生物化學(xué)檢測(cè)，分析大鼠曠場(chǎng)行為和氧化應(yīng)激參數(shù)的變化。
　　

7、結(jié)果：
　　1 TP劑量篩選的研究
　　(1)曠場(chǎng)行為：GDX組大鼠的探索行為和運(yùn)動(dòng)行為參數(shù)與Sham組相比均顯著降低(P<0.01)；TP處理從0.5mg/kg到3.0mg/kg使GDX大鼠的這兩種行為參數(shù)分別增加；0.75、1.0或1.25.0mg/kgTP處理使GDX大鼠的這兩種行為參數(shù)恢復(fù)到Sham組水平。
　　(2) Morris水迷宮
　　定位航行:Sham、GDX和GDX-TP組在行為學(xué)測(cè)試的第3天

8、、第4天與第5天存在顯著性差異(P<0.01)。GDX組在第3天、第4天和第5天與同一天Sham組相比逃避潛伏期明顯增加(P<0.01)；0.75、1.0和1.25 mg/kg組與同一天GDX組相比逃避潛伏期縮短并恢復(fù)到同一天Sham組水平。
　　空間探索: GDX組大鼠的目標(biāo)象限（第4象限）時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)次數(shù)與Sham組相比均顯著減少(P<0.01)；TP處理在0.75、1.0和1.25mg/kg組使GDX大鼠的目標(biāo)象限(

9、第4象限)時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)次數(shù)分別增加(P<0.01)，恢復(fù)到Sham組水平。
　　(3)氧化應(yīng)激參數(shù)
　　抗氧化物參數(shù)：GDX組大鼠SN和HIP線粒體的Mn-SOD、GSH-PX活力及GSH的量與Sham組相比均顯著減少(P<0.01)；GDX-TP組中，在1.0mg/kg TP時(shí)GDX大鼠SN和HIP線粒體的Mn-SOD、GSH-PX活力及GSH的量達(dá)到峰值，與Sham組沒(méi)有顯著區(qū)別。
　　脂質(zhì)過(guò)氧化物參數(shù)：G

10、DX組大鼠SN和HIP線粒體的MDA和LPO的量與Sham組相比均顯著增加(P<0.01),在1.0mg/kg GDX-TP組，GDX大鼠SN和HIP線粒體的MDA和LPO的量達(dá)到反向峰值，與Sham組沒(méi)有顯著區(qū)別。
　　2 TP處理酗酒去勢(shì)大鼠的行為和氧化應(yīng)激
　　(1)曠場(chǎng)行為：與Intact組相比，Intact-eth組的靜止聞嗅次數(shù)、探索行為次數(shù)和曠場(chǎng)中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間顯著減少、理毛潛伏期縮短(P<0.01)；理毛數(shù)量

11、、理毛持續(xù)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)行為參數(shù)增加。與 Sham組相比，GDX組大鼠靜止聞嗅、探索行為、運(yùn)動(dòng)行為、理毛數(shù)量和理毛持續(xù)時(shí)間參數(shù)降低。GDX大鼠給予1.0mg/kg TP后，靜止聞嗅、探索行為、運(yùn)動(dòng)行為、理毛數(shù)量和理毛持續(xù)時(shí)間參數(shù)恢復(fù)到Sham組水平。與GDX-eth組大鼠相比， GDX-TP-eth組靜止聞嗅、曠場(chǎng)中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間和理毛潛伏期減少；理毛數(shù)量、理毛持續(xù)時(shí)間以及運(yùn)動(dòng)行為參數(shù)增加。
　　(2)氧化應(yīng)激參數(shù)
　　抗氧化物

12、參數(shù)：Intact-eth組大鼠與Intact組相比顯著減少了SN線粒體的Mn-SOD、GSH-PX活力和GSH的量(P<0.05)。GDX組大鼠SN線粒體的Mn-SOD、GSH-PX活力及GSH的量與Sham組相比均顯著減少(P<0.01)；1.0mg/kgTP處理使GDX大鼠SN線粒體的Mn-SOD、GSH-PX活力及GSH的量恢復(fù)到Sham組水平。GDX-TP-eth組大鼠SN線粒體的Mn-SOD、GSH-PX活力及GSH的量與G

13、DX-eth組相比明顯增加(P<0.01)。
　　脂質(zhì)過(guò)氧化物參數(shù)：Intact-eth組大鼠與Intact組相比顯著增加了SN線粒體MDA和LPO的量(P<0.01)。GDX組大鼠SN線粒體MDA和LPO的量與Sham組相比均顯著增加(P<0.01)；1.0mg/kgTP處理使GDX大鼠SN線粒體MDA和LPO的量恢復(fù)到Sham組水平。GDX-TP-eth組大鼠SN線粒體MDA和LPO的量與GDX-eth組相比明顯減少(P<0.

14、01)。
　　小結(jié)：
　　1去勢(shì)大鼠補(bǔ)充0.75、1.0或1.25 mg/kg丙酸睪酮能夠恢復(fù)相關(guān)行為和氧化應(yīng)激參數(shù)。
　　2丙酸睪酮改善酒精處理大鼠氧化應(yīng)激損傷。
　　第二部分丙酸睪酮改善老年雄性大鼠黑質(zhì)線粒體復(fù)合物I酶的活性
　　目的：觀察老年雄性大鼠腦內(nèi)線粒體電子傳遞鏈酶活性的改變，補(bǔ)充丙酸睪酮是否能夠改善電子傳遞鏈的酶活性及相關(guān)mtDNA編碼亞基的表達(dá)。
　　方法：將雄性SD大鼠分為成年組(6

15、Mon)、老年組(24Mon)和老年TP組(24Mon-TP)。采用流式細(xì)胞技術(shù)觀察大鼠黑質(zhì)和海馬線粒體膜電位的變化；以生物化學(xué)方法檢測(cè)大鼠黑質(zhì)和海馬線粒體氧化應(yīng)激參數(shù)；以紫外分光光度法分析線粒體電子傳遞鏈的酶活性；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)及Western blot方法分析大鼠黑質(zhì)mtDNA編碼復(fù)合物I亞基的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1線粒體膜電位：24Mon組大鼠黑質(zhì)和海馬的Rh123熒光強(qiáng)度值與6Mon組相比均顯

16、著減少(P<0.01)；TP處理使24Mon大鼠SN(P<0.01)和HIP(P<0.05)的Rh123熒光強(qiáng)度值增加，但未恢復(fù)到6Mon組水平(P<0.01)。
　　2線粒體氧化應(yīng)激參數(shù)：24Mon組大鼠SN和HIP線粒體的Mn-SOD、GSH-PX活力及GSH的量與6Mon組相比均顯著減少(P<0.01)，MDA和LPO的量與6Mon組相比均顯著增加(P<0.01)。TP處理使24Mon大鼠SN和HIP線粒體的Mn-SOD、G

17、SH-PX活力及GSH的量增加，MDA和LPO的量減少，未恢復(fù)到6Mon組水平(P<0.01)。
　　3線粒體復(fù)合物活性：6Mon、24Mon和24Mon-TP三組大鼠間SN線粒體復(fù)合物II、III、IV酶活性和HIP線粒體復(fù)合物I、II、III、IV酶活性無(wú)顯著性差異。24Mon組大鼠SN線粒體復(fù)合物I酶活性較6Mon組降低28.94％(P<0.01)；24Mon-TP組大鼠黑質(zhì)線粒體復(fù)合物I酶活性較24Mon組增加19.89%

18、(P<0.01)，未恢復(fù)到Sham組水平(P<0.05)。
　　4黑質(zhì)mtDNA編碼復(fù)合物I亞基的mRNA：6Mon、24Mon和24Mon-TP三組大鼠mtDNA編碼復(fù)合物I亞基ND2、ND3、ND4L、ND5和ND6的mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異。與6Mon組相比，24Mon組大鼠ND1和ND4 mRNA的相對(duì)表達(dá)分別降低了27.85%和29.27%(P<0.01)；TP處理使24Mon大鼠ND1和ND4的mRNA表達(dá)比24Mon

19、組大鼠分別升高了21.05%和22.41%(P<0.01)，未恢復(fù)至6Mon組水平(P<0.01)。
　　5黑質(zhì)ND1和ND4蛋白表達(dá):24Mon組大鼠ND1、ND4蛋白的相對(duì)表達(dá)量比6Mon組分別降低了40.68%、33.33%(P<0.01)；24Mon-TP組ND1、ND4蛋白的相對(duì)表達(dá)量比24Mon組大鼠分別升高了34.29%、25%(P<0.01)，未恢復(fù)至6Mon組水平(P<0.01)。
　　6血清睪酮：24Mo

20、n組大鼠血清睪酮濃度與6Mon組相比顯著降低(P<0.01)。TP處理使24Mon大鼠血清睪酮濃度恢復(fù)到了6Mon組水平。
　　小結(jié)：
　　1老年大鼠黑質(zhì)和海馬存在線粒體的功能障礙；補(bǔ)充TP改善黑質(zhì)和海馬的線粒體功能。
　　2老年大鼠腦內(nèi)線粒體電子傳遞鏈呈現(xiàn)腦區(qū)域特異性酶活性的改變；黑質(zhì)線粒體復(fù)合物I酶活性降低；補(bǔ)充TP改善其酶活性。
　　3老年大鼠黑質(zhì)線粒體復(fù)合物I的亞基ND1、ND4表達(dá)減少，補(bǔ)充TP提高其表

21、達(dá)。
　　第三部分雄激素參與大鼠黑質(zhì)線粒體復(fù)合物I酶活性的調(diào)節(jié)
　　目的：觀察雄激素是否參與大鼠腦內(nèi)線粒體電子傳遞鏈酶活性的調(diào)節(jié)。
　　方法：選用成年健康的雄性SD大鼠，分為假手術(shù)組(Sham)、去勢(shì)組(GDX)和去勢(shì)TP組(GDX-TP)；采用流式細(xì)胞技術(shù)觀察大鼠黑質(zhì)和海馬線粒體膜電位的變化；以紫外分光光度法分析線粒體電子傳遞鏈的酶活性；應(yīng)用qPCR及Western blot方法分析大鼠黑質(zhì)mtDNA編碼復(fù)合物I亞基

22、的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1線粒體膜電位：GDX組大鼠黑質(zhì)和海馬的Rh123熒光強(qiáng)度值與Sham組相比均顯著減少(P<0.01)；TP處理使GDX大鼠黑質(zhì)和海馬的Rh123熒光強(qiáng)度值恢復(fù)到了Sham組水平。
　　2線粒體復(fù)合物活性：Sham、GDX和GDX-TP三組大鼠間黑質(zhì)線粒體復(fù)合物II、III、IV酶活性和海馬線粒體復(fù)合物I、II、III、IV酶活性無(wú)顯著性差異。GDX組大鼠黑質(zhì)線粒體復(fù)合物I酶活性較Sham組降

23、低24.32%( P<0.01)；GDX-TP組大鼠黑質(zhì)線粒體復(fù)合物I酶活性較GDX組增加38.82%( P<0.01)，恢復(fù)到Sham組水平。
　　3黑質(zhì)mtDNA編碼復(fù)合物I亞基的mRNA：Sham、GDX和GDX-TP三組大鼠 mtDNA編碼的復(fù)合物I亞基ND2、ND3、ND4L、ND5和ND6無(wú)顯著性差異。與Sham組相比，GDX組大鼠的ND1 mRNA和ND4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別降低了8.97%和14.11%(P<

24、0.01)；TP處理使GDX大鼠降低的ND1 mRNA和ND4 mRNA表達(dá)恢復(fù)至Sham組水平；與GDX組大鼠相比分別升高了9.86%和15.07%(P<0.01)。
　　4黑質(zhì)ND1和ND4蛋白表達(dá)：與Sham組相比，GDX組大鼠ND1、ND4的相對(duì)表達(dá)量分別降低了26.23%、26.47%(P<0.01)；GDX-TP組大鼠ND1、ND4的相對(duì)表達(dá)量比GDX大鼠分別升高了33.33%、30%(P<0.01)，恢復(fù)至Sham組