Ac-SDKP活化cAMP信號抑制矽肺纖維化的作用及機制.pdf

1、矽肺是由于在職業(yè)活動中長期吸入二氧化硅（SiO2）粉塵引起，其基本病理特征包括矽結(jié)節(jié)的形成和肺組織纖維化?，F(xiàn)有研究顯示，肺組織局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensinsystem, RAS）參與了肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。作為 RAS的關(guān)鍵酶，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ angiotensin converting enzyme, ACE）含有N端和C端兩個催化結(jié)構(gòu)域。其中C端結(jié)構(gòu)域能夠催化血管緊張素 I（angiotensin

2、 I, Ang I）轉(zhuǎn)化為血管緊張素 II（angiotensin II, Ang II）。而Ang II是RAS致纖維化效應(yīng)重要的活性蛋白，其作用主要由血管緊張素II的1型受體（angiotensin II type1 receptor, AT1R）介導(dǎo)，包括誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積。ACE N端結(jié)構(gòu)域可特異性水解抗纖維化短肽N-乙酰基-絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸（N-acetyl-seryl-aspar

3、tyl-lysyl-proline, Ac-SDKP），在ACE N端催化結(jié)構(gòu)域缺陷的小鼠體內(nèi)Ac-SDKP含量明顯上調(diào)，發(fā)揮抗器官纖維化效應(yīng)。同樣，給予外源性Ac-SDKP，亦能夠降低ACE野生型鼠肺損傷和肺纖維化程度。可見Ac-SDKP與RAS的交互作用，可能是其抗纖維化作用的重要分子機制之一。在本研究中，以 Ang II信號在矽肺纖維化中的作用作為研究的切入點，觀察Ac-SDKP能否通過抑制Ang II的作用調(diào)控矽肺纖維化的發(fā)生與

4、發(fā)展。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，β2腎上腺素受體-激動型 G蛋白（β2 adrenergic receptor- stimulatory G protein, ADRB2-Gs）復(fù)合物在矽肺模型中低表達(dá)，而在 Ac-SDKP抗纖維化治療組中表達(dá)顯著上調(diào)，提示該蛋白是Ac-SDKP抗矽肺纖維化中的調(diào)控蛋白之一。ADRB2抗器官纖維化作用與其促進(jìn)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）的合成有關(guān)。相關(guān)

5、研究報道，cAMP信號和Ang II/轉(zhuǎn)化生長因子（transforming gorwth factor-β1, TGF-β1）信號的交互作用在纖維化的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。cAMP信號能夠抑制Ang II/TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及膠原合成。Ang II/TGF-β1則能夠通過上調(diào)磷酸二脂酶（phosphodiesterase, PDE）加速cAMP的水解。而Ac-SDKP對cAMP信號和Ang II信號的調(diào)控

6、及Ac-SDKP能否通過cAMP信號調(diào)節(jié) Ang II信號，目前文獻(xiàn)報道較少。綜合以上研究，本實驗通過構(gòu)建矽肺動物模型結(jié)合 Ang II誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型，觀察Ac-SDKP與Ang II信號和cAMP信號的交互作用對矽肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的影響，并分析Ac-SDKP能否通過活化cAMP，促進(jìn)cAMP依賴性蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）信號及其下游的cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（cAMP-response e

7、lement binding protein, CREB），從而發(fā)揮抗矽肺纖維化的作用。以進(jìn)一步揭示矽肺發(fā)生、發(fā)展及Ac-SDKP保護(hù)效應(yīng)的可能機制。
　　第一部分Ac-SDKP、Ang II信號和cAMP信號的動態(tài)變化對矽肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的影響
　　目的：通過建立矽肺動物模型，并體外觀察 Ang II誘導(dǎo)大鼠成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效應(yīng)，分析Ac-SDKP、ACE/Ang II/AT1R軸和cAMP信號的變化對矽肺

8、纖維化發(fā)生、發(fā)展的影響。
　　方法：
　　1采用HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建大鼠矽肺模型。染塵參數(shù)：染毒室容積0.3m3，柜內(nèi)溫度20~25℃，濕度70％~75%，壓力-50Pa~+50Pa，氧氣濃度20%，SiO2粉塵進(jìn)入速度為3.0~3.5ml/min，柜內(nèi)粉塵質(zhì)量濃度2000 mg/m3，每只動物每天染塵3h。3周齡雄性Wistar大鼠隨機分為6組，每組10只。分別染塵0周、2周、4周、8周、12周、1

9、6周，觀察大鼠矽肺形成的動態(tài)變化。
　　2觀察Ang II（10-7mol/L）誘導(dǎo)不同時間點（0、5min、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h）大鼠肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效應(yīng)。
　　3采用HE染色、Masson染色法觀察肺組織病理形態(tài)的改變，分別采用免疫組織化學(xué)法、Western blot法檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、I型膠原、纖

10、連蛋白（fibronectin, Fn）、波形蛋白（Vimentin）、Gαs、抑制型G蛋白（inhibitory G protein, Gαi2/3）、ACE及AT1R的蛋白表達(dá)及定位。采用酶免疫分析法（EIA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測Ac-SDKP、Ang II和cAMP的含量。
　　結(jié)果：
　　1 HE染色結(jié)果顯示，對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰、肺泡壁薄，無明顯炎細(xì)胞浸潤。染塵2周后，可見肺泡壁增寬并伴有巨噬細(xì)胞

11、浸潤。矽肺模型4周組偶見孤立的細(xì)胞性結(jié)節(jié)形成（主要由巨噬細(xì)胞構(gòu)成）。矽肺模型8周、12周組大鼠肺組織肺泡間隔增寬明顯，且細(xì)胞性結(jié)節(jié)數(shù)量增多。矽肺模型16周組肺組織內(nèi)可見多個細(xì)胞性結(jié)節(jié)的融合和間質(zhì)纖維化的形成，并可見細(xì)胞纖維性矽結(jié)節(jié)的形成。Masson染色顯示結(jié)節(jié)及間質(zhì)纖維化區(qū)域出現(xiàn)藍(lán)紫色膠原沉積，并隨模型制備時間的延長逐漸增加，至矽肺模型16周組最為顯著。
　　2免疫組織化學(xué)染色顯示，在矽肺模型16周組，α-SMA標(biāo)記的肌成纖維細(xì)

12、胞主要位于細(xì)胞性結(jié)節(jié)周邊及間質(zhì)纖維化病變區(qū)域。Vimentin陽性表達(dá)于細(xì)胞性結(jié)節(jié)區(qū)域。Western blot結(jié)果顯示，α-SMA、I型膠原、Fn、Vimentin的蛋白表達(dá)在矽肺模型4周、8周、12周、16周較對照組逐漸增多。
　　3 Western blot及ELISA結(jié)果顯示，與對照組相比在矽肺模型2周、4周、8周、12周、16周組，ACE、Ang II、AT1R的含量逐漸升高。肺組織Ac-SDKP的水平在矽肺模型2周組較

13、對照組明顯升高，隨后在矽肺模型組4周、8周、12周、16周組含量逐漸降低。
　　4 Western blot結(jié)果顯示，Gαi2/3的蛋白表達(dá)在矽肺模型4周、8周、12周、16周組與對照組比較逐漸增多。在矽肺模型8周組Gαs的蛋白表達(dá)及cAMP的含量較對照組開始出現(xiàn)明顯降低，至染塵16周達(dá)最低。
　　5 Ang II能夠誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。α-SMA、I型膠原、Fn的蛋白表達(dá)隨誘導(dǎo)時間的延長逐漸升高。Gαs、

14、cAMP的表達(dá)隨Ang II刺激時間的延長逐漸降低，而Gαi2/3的蛋白表達(dá)逐漸升高。
　　第二部分Ac-SDKP活化cAMP/PKA信號抑制矽肺纖維化的作用及機制
　　目的：分別給予矽肺大鼠Ac-SDKP和cAMP類似物db-cAMP抗纖維化治療及預(yù)防治療。體外采用 Ang II誘導(dǎo)大鼠肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并給予Ac-SDKP、db-cAMP及選擇性PKA阻斷劑H89的預(yù)處理，觀察cAMP/PKA信號活化在Ac

15、-SDKP抑制矽肺纖維化中的作用。
　　方法：
　　1采用HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建大鼠矽肺動物模型，將動物隨機分組：1）對照16周組；2）矽肺模型16周組；3）Ac-SDKP抗纖維化治療組；4）Ac-SDKP預(yù)防治療組；5）db-cAMP抗纖維化治療組；6）db-cAMP預(yù)防治療組。
　　2原代培養(yǎng)大鼠肺成纖維細(xì)胞，實驗分組為：1）正常對照組；2） Ang II（10-7mol/L）誘導(dǎo)組；3）An

16、g II+Ac-SDKP（10-8mol/L）組；4）Ang II+Ac-SDKP+H89（10-6mol/L）組；5）Ang II+db-cAMP（10-4mol/L）組；6）Ang II+db-cAMP+H89組。
　　3采用Western blot、ELSIA法檢測體內(nèi)外α-SMA、I型膠原、Vimentin、Fn、ACE、Ang II、AT1R、Gαs、Gαi2/3、cAMP和PKA的蛋白表達(dá)。采用免疫熒光化學(xué)染色檢測矽肺

17、組織α-SMA/Gαi3及成纖維細(xì)胞α-SMA/PKA的共表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1 Western blot結(jié)果顯示，與矽肺模型16周組比較，Ac-SDKP及db-cAMP抗纖維化治療組和預(yù)防治療組α-SMA、I型膠原、Fn和Vimentin的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。
　　2 Western blot結(jié)果顯示，Ac-SDKP、db-cAMP抗纖維化治療組和預(yù)防治療組，AT1R的蛋白表達(dá)較矽肺模型16周組明顯降低，ACE和A

18、ng II的表達(dá)在Ac-SDKP和db-cAMP治療組下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3免疫熒光化學(xué)染色顯示，在矽肺模型16周組，纖維化病變區(qū)域有大量綠色熒光標(biāo)記的α-SMA陽性表達(dá)。Gαi3紅色熒光的表達(dá)亦顯著增加，采用兩種蛋白熒光組合定位技術(shù)，可見α-SMA和Gαi3共表達(dá)于矽結(jié)節(jié)及間質(zhì)纖維化區(qū)域。Ac-SDKP、db-cAMP抗纖維化治療組和預(yù)防治療組， Gαi3與α-SMA的陽性表達(dá)降低。Western blot結(jié)果顯示，

19、與矽肺模型16周組相比，在Ac-SDKP、db-cAMP治療組，Gαi2/3蛋白表達(dá)下降，Gαs、cAMP、PKA蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。
　　4免疫組織化學(xué)染色顯示，經(jīng)Ang II誘導(dǎo)24h后，與對照組相比，胞漿內(nèi)有大量α-SMA陽性表達(dá)。給予 Ac-SDKP和 db-cAMP干預(yù)后，α-SMA陽表達(dá)明顯減弱。而H89能夠顯著抑制Ac-SDKP和db-cAMP作用。Western blot結(jié)果顯示，Ac-SDKP、db-cAMP干預(yù)能

20、明顯下調(diào)Ang II誘導(dǎo)的α-SMA、I型膠原和Fn的蛋白表達(dá)。Ac-SDKP+H89、db-cAMP+H89干預(yù)組α-SMA、I型膠原、Fn的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。
　　5 Western blot結(jié)果顯示，給以Ac-SDKP、db-cAMP預(yù)處理，Gαi2/3蛋白的表達(dá)均較Ang II誘導(dǎo)組下調(diào)，Gαs的蛋白表達(dá)較Ang II誘導(dǎo)組上調(diào)。Ac-SDKP+H89、db-cAMP+H89干預(yù)組Gαi2/3蛋白表達(dá)明顯升高，Gαs蛋白的

21、表達(dá)明顯降低。
　　6免疫熒光染色檢測α-SMA/PKA共表達(dá)結(jié)果顯示，對照組PKA蛋白陽性表達(dá)于細(xì)胞漿及細(xì)胞核中，胞漿中α-SMA纖維狀結(jié)構(gòu)呈微弱表達(dá)或無表達(dá)。經(jīng)Ang II誘導(dǎo)24h后，與對照組相比，PKA蛋白陽性表達(dá)減弱，α-SMA陽性表達(dá)則明顯增強。給予Ac-SDKP和db-cAMP干預(yù)后，與Ang II組相比，PKA陽性表達(dá)明顯增強，α-SMA陽性表達(dá)明顯降低。而H89阻斷了 Ac-SDKP和 db-cAMP的作用。We

22、stern blot結(jié)果顯示，予以Ac-SDKP、db-cAMP干預(yù)后，與Ang II組比較，cAMP、PKA蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。Ac-SDKP+H89、db-cAMP+H89干預(yù)組cAMP、PKA蛋白表達(dá)下降。
　　第三部分Ac-SDKP調(diào)節(jié)pCREB、pSmad2/3信號抑制矽肺纖維化的作用及機制
　　目的：采用矽肺動物模型及體外細(xì)胞培養(yǎng)，觀察Ac-SDKP抑制矽肺纖維化的作用是否與調(diào)控pCREB、pSmad2/3信號有關(guān)

23、。
　　方法：
　　1采用HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建大鼠矽肺模型，動物被隨機分為：1）對照16周組；2）矽肺模型16周組；3）Ac-SDKP抗纖維化治療組；4）Ac-SDKP預(yù)防治療組；5）db-cAMP抗纖維化治療組；6） db-cAMP預(yù)防治療組。
　　2大鼠肺成纖維細(xì)胞分別給予以下處理:1）正常對照組；2）Ang II（10-7mol/L）誘導(dǎo)組；3） Ang II+Ac-SDKP（10-8mo

24、l/L）組；4） Ang II+Ac-SDKP+H89（10-6mol/L）組；5）Ang II+db-cAMP（10-4mol/L）組；6）Ang II+db-cAMP+H89組。
　　3采用Western blot檢測矽肺組織及成纖維細(xì)胞中pCREB、CREB、pSmad2/3和 Smad2/3的蛋白表達(dá)。免疫熒光染色法檢測體內(nèi)外pCREB/α-SMA、pSmad2/3與α-SMA的共表達(dá)，應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)觀察成纖維細(xì)胞核中

25、pCREB、pSmad2/3與CREB結(jié)合蛋白（CREB binding protein, CBP）的相互作用。
　　結(jié)果：
　　1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，pCREB在肺泡上皮細(xì)胞中陽性表達(dá)較為顯著，在矽結(jié)節(jié)內(nèi)陽性表達(dá)減弱。而pSmad2/3在矽結(jié)節(jié)內(nèi)陽性表達(dá)顯著升高。免疫熒光化學(xué)染色顯示，在正常對照組中，可見紅色熒光標(biāo)記的pSmad2/3蛋白微弱表達(dá)于細(xì)胞核中，α-SMA蛋白綠色熒光主要表達(dá)于氣管平滑肌細(xì)胞。矽肺模型16

26、周組，α-SMA蛋白主要表達(dá)于矽結(jié)節(jié)周圍及肺泡壁增寬區(qū)域，pSmad2/3蛋白亦在上述部位的細(xì)胞核中表達(dá)明顯增多，將兩種熒光標(biāo)記的蛋白圖像組合后發(fā)現(xiàn)，纖維化病變區(qū)域的一些細(xì)胞胞漿內(nèi)既有α-SMA蛋白陽性表達(dá)，又有細(xì)胞核中pSmad2/3蛋白的陽性表達(dá)。在 Ac-SDKP及 db-cAMP抗纖維化治療和預(yù)防治療組中，pSmad2/3蛋白和α-SMA蛋白陽性表達(dá)減弱。Western blot結(jié)果顯示，在矽肺模型16周組 pCREB蛋白表達(dá)下

27、調(diào)，pSmad2/3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。Ac-SDKP、db-cAMP治療組，促進(jìn)了pCREB蛋白表達(dá)，抑制了pSmad2/3蛋白表達(dá)。CREB、Smad2/3的蛋白表達(dá)無明顯差異。
　　2免疫熒光染色觀察α-SMA/pCREB的共定位表達(dá)結(jié)果顯示，在對照組，pCREB較多表達(dá)于細(xì)胞核，胞漿中亦有表達(dá)，而α-SMA呈微弱表達(dá)或無表達(dá)。經(jīng)Ang II誘導(dǎo)24h后，細(xì)胞中pCREB陽性表達(dá)顯著下降，α-SMA陽性表達(dá)則明顯增強。分別給予

28、 Ac-SDKP和 db-cAMP干預(yù)后，細(xì)胞中α-SMA表達(dá)明顯減弱，pCREB陽性表達(dá)明顯增強。H89能夠顯著抑制Ac-SDKP和db-cAMP的作用。免疫熒光染色結(jié)果還顯示，Ang II能夠顯著增強細(xì)胞核中pSmad2/3表達(dá)及細(xì)胞漿中α-SMA的表達(dá)。Ac-SDKP及db-cAMP預(yù)處理，降低了成纖維細(xì)胞中pSmad2/3和α-SMA的共表達(dá)。H89能夠顯著阻斷Ac-SDKP和db-cAMP的作用。Western blot結(jié)果顯

29、示，經(jīng)Ang II誘導(dǎo)24h后，成纖維細(xì)胞pCREB的表達(dá)降低，pSmad2/3蛋白的表達(dá)顯著增強。Ac-SDKP、db-cAMP預(yù)處理后明顯促進(jìn)了pCREB的表達(dá)，降低了 pSmad2/3的蛋白表達(dá)。H89預(yù)處理取消了 Ac-SDKP、db-cAMP的上述作用。CREB、Smad2/3的蛋白表達(dá)無明顯差異。
　　3成纖維細(xì)胞免疫共沉淀結(jié)果顯示，CBP能夠分別與 pSmad2/3和pCREB結(jié)合。在Ang II誘導(dǎo)組，pSmad2

30、/3與CBP的結(jié)合上調(diào)，而pCREB與CBP的結(jié)合降低。給予Ac-SDKP、db-cAMP預(yù)處理，促進(jìn)了pCREB與CBP的結(jié)合，降低了pSmad2/3與CBP的結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　1矽肺組織局部ACE/Ang II/AT1R在矽肺發(fā)生、發(fā)展過程中逐漸升高，并且體外 Ang II能夠刺激肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；Ac-SDKP、cAMP的表達(dá)在矽肺發(fā)生、發(fā)展過程中呈下降趨勢。Ac-SDKP與cAMP信號和Ang