以cpsB基因測序為主的序貫分子生物學(xué)方法檢測肺炎鏈球菌血清型及臨床應(yīng)用研究.pdf

1、本研究主要目的是以國內(nèi)兒童肺炎鏈球菌血清型分布狀況為基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)方法為手段，建立一種簡單、實用、適合發(fā)展中國家使用的肺炎鏈球菌血清型檢測“雞尾酒”策略，即將cpsB基因測序輔以優(yōu)化的序貫mPCR及血清型6A-6D特異PCR相結(jié)合，并將該策略運用于肺炎鏈球菌臨床株血清型的測定，結(jié)合耐藥性檢測，對評價本地區(qū)疫苗的覆蓋率和有效性，指導(dǎo)合理臨床用藥提供更好的流行病學(xué)證據(jù)。
　　第一部分 cpsB基因測序檢測肺炎鏈球菌血清序列型

2、>　　目的：利用已建立的cpsB基因測序方法對我們臨床收集的肺炎鏈球菌株進行血清序列型檢測，同時建立涵蓋目前已知肺炎鏈球菌95個血清型cpsB基因序列型數(shù)據(jù)庫，將該方法進一步完善，提高檢測的準(zhǔn)確性。
　　方法：下載GenBank中收錄（截止2015年1月1日）肺炎鏈球菌所有cpsB基因全長的序列，應(yīng)用GenBank中的ClustalW軟件和/或Blastn軟件對下載的序列進行列對、比對分析，建立肺炎鏈球菌95個血清型cpsB基因序

3、列型數(shù)據(jù)庫。對2009年～2013年收集的我院5歲以下住院兒童中肺炎鏈球菌性疾病不同樣本來源不重復(fù)肺炎鏈球菌菌株193株，用特異性引物cps1/cps2進行單步PCR擴增cpsB基因目的片段，繼之進行雙向測序。測序結(jié)果與GenBank中的序列進行比對，參照我們建立的cpsB基因序列型數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)確定血清型序列型。
　　結(jié)果：我們建立的數(shù)據(jù)庫包括GenBank中（截止2015年1月1日）所有的390個含cpsB基因全長的GenBan

4、k收錄號，包含目前所知肺炎鏈球菌95個血清型cpsB基因732bp標(biāo)準(zhǔn)序列型的數(shù)據(jù)資料。所有193株臨床分離的肺炎鏈球菌菌株進行cpsB基因擴增均成功?；赾psB基因在一個或多個位點的異質(zhì)性，一共識別出21個序列型。其中8個序列型(3，9V，6B，10B，14，19A，23F，23A)是血清型特異序列型，可以由序列型直接預(yù)測出菌株的血清型;5個序列型(6C-6D，6B-6E-6X，15B-15C，19F-19A及28F-28A)是同一

5、個血清群不同血清型共享序列型，可以由序列型直接預(yù)測出菌株相應(yīng)的血清群;3個序列型(13-20，15A-33B，17A-34)雖然也屬于多個血清型共享序列型，但無法明確菌株具體屬于哪個血清型。通過cpsB基因測序方法，193株菌中34.2％的菌可直接確定其血清型;55.4％的菌可確定至相應(yīng)血清群水平。
　　結(jié)論：本研究建立的肺炎鏈球菌95個血清型cpsB基因序列型數(shù)據(jù)庫對分子生物學(xué)方法檢測血清序列型是一個補充和完善。應(yīng)用單步PCR進

6、行cpsB基因測序確定肺炎鏈球菌血清序列型可以作為血清型檢測的初篩。
　　第二部分 優(yōu)化的序貫mPCR方法檢測肺炎鏈球菌血清型
　　目的：根據(jù)我國兒童肺炎鏈球菌血清型分布狀況，對美國CDC推薦的序貫mPCR方法進行優(yōu)化組合，建立一個適合我國兒童血清型檢測的序貫mPCR方法，可以在最初三個mPCR反應(yīng)中識別出最常見血清型。
　　方法：采用優(yōu)化的序貫mPCR方法對收集的193株菌進行肺炎鏈球菌血清型檢測。參照美國CDC網(wǎng)站

7、公布的引物序列合成肺炎鏈球菌40對血清型特異性引物和1對莢膜特異性引物。根據(jù)我國兒童肺炎鏈球菌血清型分布狀況，對美國CDC推薦的序貫mPCR前三步反應(yīng)中引物進行優(yōu)化組合。優(yōu)化后的前三步mPCR反應(yīng)可識別十個血清群/型，包括我國兒童最常見血清群/型19F，19A，14，23F及6，PCV-7中包含的三個血清型4，9V/9A及18C，以及近些年在血清型替換中越來越受到關(guān)注的血清型15B/15C和15A/15F。第一步mPCR反應(yīng)包含血清群/

8、型9V/9A、14、23F、15B/15C的特異性引物;第二步mPCR反應(yīng)包含血清群/型4，6和19A的特異性引物;第三步mPCR反應(yīng)包含血清型15A/15F，18C和19F的特異性引物。每一步mPCR反應(yīng)中均加入莢膜特異性引物作為內(nèi)部陽性對照。如果一個標(biāo)本在前三步mPCR反應(yīng)中檢測均陰性，則需要按照美國CDC推薦的方法進行序貫8個mPCR反應(yīng)。
　　結(jié)果：從193株臨床肺炎鏈球菌菌株中一共識別出肺炎鏈球菌12個血清群/型，包括:

9、3（2株），6(27株)，9V/9A（3株），14（14株），15F/15A（2株），15B/15C（13株），19F（67株），19A（23株），20（2株），23F（33株），23A（2株）和34（1株）。血清型4和18C在本研究中沒有該型菌株，故擴增陰性。通過優(yōu)化的序貫mPCR前三步反應(yīng)可識別大多數(shù)菌株的血清型，僅11株菌(5.7％)需要進行美國CDC推薦的序貫8步mPCR反應(yīng)鑒定，其中4株菌(2.1％)改用后者依然不能進行分型。

10、序貫mP.CR方法無法分型的4株菌中2株菌cpsB基因測序顯示序列型為10B，28F-28A。另有2株菌應(yīng)用兩種方法均無法分型，需要進行莢膜腫脹試驗鑒定。cpsB基因測序與mPCR結(jié)果相比，兩者一致性可達92.2％。cpsB基因測序提示序列型是15A-33B，13-20A-20B，17A-34，序貫mPCR確定其血清型分別為15F/15A，20以及34，并證實13株肺炎鏈球菌cpsB基因血清序列型為新的序列型。
　　結(jié)論：根據(jù)中國

11、兒童血清型分布狀況，優(yōu)化的序貫mPCR反應(yīng)用于肺炎鏈球菌血清分型可以彌補基因測序的不足，提高檢測準(zhǔn)確性，并且在前三步mPCR反應(yīng)中識別出常見血清型。
　　第三部分 血清型6A-6D特異PCR方法檢測血清6群肺炎鏈球菌
　　目的：應(yīng)用我們已建立的血清型6A-6D特異PCR方法對cpsB基因測序及序貫mPCR識別出的肺炎鏈球菌血清6群菌株進一步細分其血清型。
　　方法：收集cpsB基因測序及序貫mPCR方法均鑒定為血清6群

12、的27株肺炎鏈球菌菌株DNA。用特異性引物wciP584aS/wciP-r(6B)和wciP584gS/wciP-r(6A)，通過單步PCR擴增wciP基因，初步將血清6群菌株區(qū)分為血清型6A/6C與6B/6D;對血清型6A/6C與6B/6D菌株，用特異性引物wciNβS1/wciNβA2再次采用單步PCR擴增wciNβ基因，從6A/6C與6B/6D中分別區(qū)分血清型6C與6D菌株。
　　結(jié)果：27株cpsB測序和序貫mPCR方法均

13、鑒定為血清6群的肺炎鏈球菌，我們采用血清型6A-6D特異PCR細分血清型，發(fā)現(xiàn)12株血清型6A(12/27，44.4％)，13株6B(13/27，48.1％)，2株6C(2/27，7.4％)，沒有發(fā)現(xiàn)6D菌株。
　　結(jié)論：本研究再次證實血清型6A-6D特異PCR方法能快速、簡單、有效的區(qū)分血清6群肺炎鏈球菌。
　　第四部分 cpsB基因測序輔以mPCR、血清型6A-6D特異PCR檢測肺炎鏈球菌血清型的“雞尾酒”策略及臨床應(yīng)用

14、
　　目的：應(yīng)用cpsB基因測序輔以優(yōu)化的序貫mPCR、血清型6A-6D特異PCR的肺炎鏈球菌血清分型“雞尾酒”策略，對我院臨床收集193株肺炎鏈球菌進行血清分型，并對耐藥性進行檢測。旨在尋找一種適合于我國流行病學(xué)調(diào)查和研究的肺炎鏈球菌血清分型策略，并提供直接來自社區(qū)的肺炎鏈球菌血清型、耐藥性、疫苗覆蓋情況等資料。
　　方法：收集2009年～2013年我院5歲以下住院兒童中肺炎鏈球菌性疾病的肺炎鏈球菌193株。首先采用cps

15、B基因測序初篩，確定血清序列型;對cpsB基因測序有歧義的結(jié)果或不能分型、新的cpsB序列型菌株應(yīng)用優(yōu)化的序貫mPCR方法明確血清型;對上述方法確定為血清6群的菌株應(yīng)用血清型6A-6D特異PCR方法細分血清型6A，6B，6C和6D。將本次研究中發(fā)現(xiàn)新的cpsB基因序列上傳GenBank。采用K-B法對193株菌進行抗菌素藥物敏感試驗，根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI)2013年版標(biāo)準(zhǔn)進行判讀。
　　結(jié)果：193株肺炎鏈球菌

16、中共識別出16個血清型。初篩后，59.5％菌株序列型的結(jié)果需要進一步采用優(yōu)化的序貫mPCR方法給予明確。大多數(shù)菌株血清型在序貫mPCR的前3個反應(yīng)中可以識別，僅5.7％的菌株需要進行8個mPCR反應(yīng)。多重耐藥菌比例高達86.8％，最常見耐藥模式:紅霉素+克林霉素+復(fù)方新諾明。按非腦膜炎標(biāo)準(zhǔn)未檢測出耐青霉素肺炎鏈球菌，按腦膜炎標(biāo)準(zhǔn)和口服標(biāo)準(zhǔn)對青霉素耐藥性顯著增加，分別為88.6％和39.2％。
　　結(jié)論：(1)對國內(nèi)尚無法采用傳統(tǒng)莢

17、膜腫脹試驗進行SP血清分型的地區(qū)，本研究建立的cpsB基因測序輔以優(yōu)化的序貫mPCR、血清型6A-6D特異PCR的“雞尾酒”策略是一個值得推廣的分子生物學(xué)檢測策略;(2)血清型19A已經(jīng)成為南方沿海地區(qū)一個常見的血清型;PCV-13血清覆蓋率高，可為本地區(qū)兒童提供更好的免疫保護;血清15群（尤其15B/15C）的比例高于國內(nèi)其它地區(qū)報道值得引起關(guān)注;(3)小于5歲兒童肺炎鏈球菌多重耐藥比例高，應(yīng)避免使用紅霉素、克林霉素和復(fù)方新諾明治療P