乙型肝炎病毒X蛋白通過CDC42蛋白誘發(fā)Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌是世界第五大流行癌癥，致死率非常高。慢性乙型肝炎病毒(HepatitisB virus，HBV)感染被認(rèn)為是誘發(fā)肝癌的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)HBV基因組X基因編碼的X蛋白(hepatitsis B virus X protein，HBx)在HBV復(fù)制和誘發(fā)肝癌過程中具有重要作用。課題組前期對(duì)HBx轉(zhuǎn)基因小鼠SILAC（Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture）定

2、量蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在HBx誘發(fā)小鼠肝臟由重度炎癥轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y過程中，CDC42信號(hào)通路相關(guān)分子及CDC42蛋白本身蛋白表達(dá)量上調(diào)，提示在HBx誘發(fā)小鼠肝癌過程中，CDC42信號(hào)通路被激活。激活的CDC42可參與多條信號(hào)通路，引起細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力等改變。為了解CDC42蛋白是否參與以及如何參與HBx介導(dǎo)的Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，本研究首先通過CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)Huh7-HBx細(xì)胞中的CDC42基因進(jìn)行修飾，而

3、后通過添加CDC42特異性抑制劑CASIN抑制Huh7-mock細(xì)胞和Huh7-HBx細(xì)胞中CDC42活性，探究CDC42功能破壞時(shí)HBx介導(dǎo)的Huh7惡性轉(zhuǎn)化程度變化，進(jìn)而揭示CDC42在HBx誘發(fā)人肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用。研究結(jié)果將為深入理解HBV致癌機(jī)制、尋找HBV相關(guān)肝癌的治療靶標(biāo)提供理論依據(jù)。
　　具體研究結(jié)果如下:
　　1.HBx介導(dǎo)Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化
　　為了解HBx基因的異常表達(dá)是否可引起人肝癌細(xì)胞系

4、Huh7細(xì)胞系的惡性轉(zhuǎn)化，首先應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Huh7-mock細(xì)胞和Huh7-HBx細(xì)胞中HBx基因表達(dá)情況，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)2種細(xì)胞的增殖能力、Annex V和FITC試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，并通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBx基因轉(zhuǎn)染前后Huh7細(xì)胞遷移能力的變化情況。結(jié)果顯示:(1)Huh7-HBx細(xì)胞中HBx基因的表達(dá)顯著高于Huh7-mock細(xì)胞(p＜0.01);(2) Huh7-HBx細(xì)胞的增殖能力顯著高于Huh7-

5、mock細(xì)胞(p＜0.01);(3)Huh7-HBx細(xì)胞的抗凋亡能力顯著高于Huh7-mock細(xì)胞（流式細(xì)胞儀分析）。(4) Huh7-HBx細(xì)胞的遷移能力高于Huh7-mock細(xì)胞;(5)與Huh7-mock細(xì)胞相比，Huh7-HBx細(xì)胞中CDC42蛋白表達(dá)量升高(Western blot分析)。
　　2.HBx介導(dǎo)Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化依賴CDC42
　　為了驗(yàn)證CDC42蛋白是否參與HBx介導(dǎo)的Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，首先

6、應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)Huh7-HBx細(xì)胞中CDC42基因進(jìn)行編輯，檢測(cè)CDC42基因敲除前后細(xì)胞的增殖能力、凋亡水平及遷移能力，而后采用CDC42蛋白特異性抑制劑CASIN處理Huh7-mock細(xì)胞和Huh7-HBx細(xì)胞，了解其對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)獲得在CDC42基因第二外顯子處具有4個(gè)堿基缺失的突變體細(xì)胞(Huh7-HBx CDC42KO);(2) Huh7-HBx CDC42 KO細(xì)胞增殖能力顯著

7、低于Huh7-HBx細(xì)胞(p＜0.01);(3) Huh7-HBx CDC42 KO細(xì)胞群體中晚期凋亡細(xì)胞比例升高，即細(xì)胞抗凋亡能力顯著下降;(4) Huh7-HBx CDC42 KO細(xì)胞的遷移能力低于Huh7-HBx細(xì)胞;(5)不同濃度CASIN處理一定時(shí)間后，Huh7-HBx細(xì)胞的增殖能力顯著降低(p＜0.01)，而Huh7細(xì)胞的增殖能力沒有顯著變化;Huh7-HBx細(xì)胞的抗凋亡能力顯著下降(p＜0.01)，而Huh7細(xì)胞抗凋亡能力

8、在抑制劑處理前后沒有顯著變化。
　　3.CDC42參與HBx介導(dǎo)Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的定量蛋白質(zhì)組研究
　　為了鑒定參與HBx介導(dǎo)Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的CDC42蛋白下游效應(yīng)因子，利用基于質(zhì)量虧損的準(zhǔn)等重二甲基標(biāo)記技術(shù)分別對(duì)Huh7-mock細(xì)胞和Huh7-HBx細(xì)胞的全蛋白在肽段水平進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記，混合后的肽段經(jīng)離線液相分離，Q Exactive HF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，pFind3.0搜索引擎處理數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示:(1)在H

9、uh7-HBx(30L)和Huh7-HBx CDC42 KO(30H)組數(shù)據(jù)中，共定量到4436個(gè)蛋白，其中差異蛋白為523個(gè)，上調(diào)蛋白為239個(gè)，下調(diào)蛋白共284個(gè);(2)下調(diào)蛋白的功能主要聚集在細(xì)胞死亡、細(xì)胞凋亡等途徑;(3) IQGAP1蛋白作為CDC42的下游效應(yīng)因子可能參與了HBx介導(dǎo)的Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。
　　以上研究結(jié)果表明，HBx進(jìn)入Huh7細(xì)胞后，通過調(diào)控CDC42蛋白活性，使其與IQGAP1結(jié)合，導(dǎo)致Huh7