神經(jīng)降壓素NTS及其受體NTSR1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤是具有高度侵襲性和致死性的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，約占成人顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤的80％。盡管近年來綜合治療策略（聯(lián)合手術(shù)、放療和化療）在臨床中的廣泛運(yùn)用并取得了一定效果，但多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)患者的中位生存期仍然少于15個月。惡性增殖是膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)之一，導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性增殖的重要原因是腫瘤細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定和功能基因組的異常表達(dá)。因此，深入探討膠質(zhì)細(xì)胞增殖和腫瘤生長的分子機(jī)

2、制將有助于解釋其惡性增殖現(xiàn)象。
　　神經(jīng)降壓素(neurotensin，NTS)是由13個氨基酸殘基組成的直鏈多肽，作為神經(jīng)遞質(zhì)和激素樣神經(jīng)肽廣泛分布并作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)降壓素和高親和力受體1(neurotensin receptor1，NTSR1)在多種腫瘤的病理進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。因此，NTS/NTSR1有望成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，但目前尚無文獻(xiàn)報道NTS/NTSR1在惡性膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)效應(yīng)及其分

3、子機(jī)制。
　　微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類內(nèi)源性、短鏈、高度保守的非編碼RNA。miRNAs和相應(yīng)蛋白形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC作用于靶點(diǎn)mRNA的3端非轉(zhuǎn)錄區(qū)，以轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)方式抑制靶點(diǎn)mRNA翻譯成蛋白質(zhì)或降解該mRNA。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)人體約有30％-60％基因的表達(dá)受到微小RNA的調(diào)控，其中包括眾多細(xì)胞周期調(diào)控因子。<

4、br>　　本研究采用體外和體內(nèi)實驗觀察NTS/NTSR1、miRNAs和c-Myc對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和移植瘤生長的影響;采用miRNAs芯片、熒光定量PCR和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗論證NTS/NTSR1如何調(diào)控miRNAs的表達(dá);采用熒光素酶報告基因和正反論證法觀察miRNAs和CDKs之間的關(guān)聯(lián);采用western blot、熒光定量PCR和正反論證法探討NTS/NTSR1如何調(diào)控CDK4的表達(dá)。旨在探討NTS/NT

5、SR1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制，為研究控制膠質(zhì)瘤生長和改善患者預(yù)后提供實驗依據(jù)和新的治療靶點(diǎn)。
　　主要結(jié)果:
　　1.NTS/NTSR1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、G1/S期進(jìn)展和皮下移植瘤生長
　　NTS在體外具有促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和G1/S期進(jìn)展的能力，而使用NTSR1的特異性拮抗劑SR48692或siNTSR1可以顯著逆轉(zhuǎn)NTS對細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展的促進(jìn)作用;沉默膠質(zhì)瘤細(xì)胞NTSR1的表達(dá)可以顯著

6、抑制皮下移植瘤的生長;NTS/NTSR1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響主要通過調(diào)控G1/S期進(jìn)展而不是通過影響細(xì)胞凋亡;NTS/NTSR1對G1/S期進(jìn)展的促進(jìn)作用主要通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)CDK6的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)CDK4表達(dá)來實現(xiàn)。
　　2.NTS/NTSR1通過c-Myc/miR-29b-1和miR-129-3p調(diào)節(jié)CDK6蛋白的表達(dá)
　　NTS/NTSR1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-29b-1和miR-129-3p的表達(dá)，這兩

7、個miRNAs均可以作用于CDK6 mRNA的3端非轉(zhuǎn)錄區(qū)并抑制CDK6蛋白的表達(dá);NTS/NTSR1通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的表達(dá)繼而作用于miR-29b-1的啟動子并抑制其表達(dá)。
　　3.NTS/NTSR1通過轉(zhuǎn)錄因子c-Myc在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)CDK4的表達(dá)
　　NTS促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的表達(dá)，該過程需要NTSR1的參與;轉(zhuǎn)錄因子c-Myc通過和CDK4的啟動子結(jié)合繼而促進(jìn)CDK4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　

8、4.miR-29b-1、miR-129-3p和轉(zhuǎn)錄因子c-Myc影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、G1/S期進(jìn)展、顱內(nèi)原位移植瘤生長和荷瘤裸鼠生存時間
　　miR-29b-1和miR-129-3p抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和G1/S期進(jìn)展;在U87-NTSR1-SH細(xì)胞中干擾miR-29b-1和miR-129-3p的功能可以恢復(fù)顱內(nèi)原位移植瘤的生長;在U87-NTSR1-SH細(xì)胞中過表達(dá)c-Myc或干擾miRNAs的功能均可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和G1/

9、S期進(jìn)展，兩者聯(lián)合運(yùn)用具有協(xié)同促進(jìn)作用。
　　綜上所述，NTS/NTSR1可以在體外促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和G1/S期進(jìn)展，在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤組織的生長，而沉默NTSR1可以逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象;NTS/NTSR1通過抑制miR-29b-1和miR-129-3p表達(dá)繼而解除這兩個miRNAs對CDK6蛋白表達(dá)的抑制作用;NTS/NTSR1通過促進(jìn)c-Myc表達(dá)一方面抑制miR-29b-1的表達(dá)，另一方面促進(jìn)CDK4的轉(zhuǎn)錄;NTS/NTSR促進(jìn)膠質(zhì)