新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法建立及應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　利用新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(New Dehli Metallo-β-1actamase1，NDM-1)的原核表達載體誘導(dǎo)表達NDM-1與6×His標簽的融合蛋白，通過親和層析法純化NDM-1蛋白，采用體內(nèi)培養(yǎng)法，能將穩(wěn)定分泌抗NDM-1單克隆抗體的雜交瘤細胞株3F8接種于BALB/c小鼠腹腔，制備鼠抗NDM-1單克隆抗體;以單克隆抗體和膠體金標記技術(shù)為基礎(chǔ)，根據(jù)競爭抑制原理，建立NDM-1的斑點金免疫滲濾檢測方法，并

2、應(yīng)用于細菌培養(yǎng)物中NDM-1的檢測。
　　方法：
　　1.采用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)攜帶NDM-1的原核表達載體的宿主菌表達NDM-1-6×His的融合蛋白，以SDS-PAGE電泳鑒定蛋白的分子量，將重組基因工程菌擴大培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達，最后采用親和層析法純化誘導(dǎo)的目的蛋白，并研究它的酶促動力學(xué)特征。
　　2.抗NDM-1單克隆抗體的制備與純化
　　采用體內(nèi)培養(yǎng)法，將能夠穩(wěn)定分泌抗NDM-1單克

3、隆抗體的雜交瘤細胞株3F8接種于BALB/c小鼠腹腔，每只BALB/c小鼠接種106個雜交瘤細胞，共接種6只，獲得含有抗體的腹水36ml。通過親和層析法純化，5ml親和層析柱，每次可獲得4.50 mg高純度的抗NDM-1單克隆抗體。采用ELISA法分析抗體免疫活性。
　　3.膠體金及免疫金探針的制備
　　采用檸檬酸三鈉還原法，成功制備20 nm膠體金溶膠;此基礎(chǔ)上建立抗NDM-1單克隆抗體的膠體金標記條件:最佳標記pH值為7

4、.4，最佳標記量為8μg抗NDM-1單克隆抗體/ml膠體金。采用ELISA方法分析了免疫金探針活性。
　　結(jié)果：
　　1.表達并純化獲得具酶活性的NDM-1-6×His融合蛋白，經(jīng)酶促動力學(xué)實驗證明純化的融合蛋白具有較高的酶活性。
　　2.NDM-1斑點金免疫滲濾檢測方法的建立
　　根據(jù)競爭抑制原理，以金標抗NDM-1單克隆抗體作為分析探針，NDM-1完全抗原NDM-1偶聯(lián)物作為包被抗原，羊抗鼠IgG為質(zhì)控點，初

5、步建立了NDM-1的斑點金免疫滲濾檢測體系(dot immunogold assay，DIGA)。當包被抗原濃度為6ng/ml，免疫金探針為原液時，肉眼判定NDM-1陽性，檢測限為6ng/ml，檢測時間為10min左右.
　　結(jié)論：
　　本研究獲得了高效的重組基因工程大腸桿菌表達菌株，制備鼠抗NDM-1單克隆抗體;以單克隆抗體和膠體金標記技術(shù)為基礎(chǔ)，根據(jù)競爭抑制原理，建立了NDM-1的斑點金免疫滲濾檢測方法，并將其初步應(yīng)用于