唐氏綜合征小鼠神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白的篩選與驗證.pdf

1、背景:
　　唐氏綜合征（Down’s syndrome，DS）是最常見的染色體疾病和出生缺陷，其多余的一條21號染色體阻礙了兒童的生長發(fā)育，并且造成嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺陷。DS患者的神經(jīng)功能缺陷不僅會造成認(rèn)知能力的丟失，還能導(dǎo)致早發(fā)性老年性癡呆的發(fā)生。因此，加強(qiáng)DS神經(jīng)缺陷的研究，對延緩其腦損傷、改善認(rèn)知能力、提高生活質(zhì)量具有重大的意義。細(xì)胞凋亡在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。DS是一種類似于老年性癡呆（Alzheimer diseas

2、e，AD）的神經(jīng)退行性病變，目前細(xì)胞凋亡對DS發(fā)生的影響尚未有定論。本研究從蛋白組學(xué)入手，篩選DS小鼠海馬差異蛋白的表達(dá)，通過差異蛋白的生物信息學(xué)分析挑選出關(guān)鍵的蛋白分子，從組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)角度探討該分子與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系。本研究將有助于闡明DS神經(jīng)功能缺損的分子機(jī)制。
　　目的:
　　（1）以Ts65Dn小鼠作為DS模型，采用iTRAQ技術(shù)篩選鑒定其海馬組織中的差異蛋白表達(dá)，為深入研究DS神經(jīng)缺陷的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)；

3、　?。?）運用生物學(xué)信息學(xué)分析，明確差異蛋白的性狀及其相互作用，揭示差異蛋白與DS神經(jīng)缺陷發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性；
　?。?）明確DS海馬神經(jīng)元的凋亡狀態(tài)，初步證實Akt蛋白異常表達(dá)與DS神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系，進(jìn)一步驗證蛋白組學(xué)結(jié)果。
　　方法:
　?。?）Ts65Dn小鼠傳代繁殖：用Ts65Dn小鼠作為DS模型，雌雄合籠繁殖子代，以第一代小鼠（16~18周）作為本研究對象。按照J(rèn)ackson Laboratory推薦采用分子

4、生物學(xué)方法檢測小鼠17號染色體GRCm38.p1突變進(jìn)行子鼠品系的鑒定。
　　（2）應(yīng)用iTRAQ技術(shù)篩選DS小鼠海馬組織的差異蛋白：收集小鼠海馬組織，采用蛋白電泳、蛋白質(zhì)譜的方法進(jìn)行預(yù)實驗，證實樣本蛋白含量符合要求。在此基礎(chǔ)上采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白電泳，之后進(jìn)行酶解和肽段定量；采用iTRAQ4標(biāo)試劑盒進(jìn)行肽段標(biāo)記；經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析；采用Mascot2.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索及鑒定，采用Proteome

5、 Discoverer1.3軟件對肽段報告離子峰強(qiáng)度值進(jìn)行定量分析。
　?。?）差異蛋白的生物信息學(xué)分析：針對iTRAQ技術(shù)在Ts65Dn小鼠海馬組織中篩選鑒定到的374個差異蛋白，分別采用 GO功能分析和富集分析、KEGG通路分析、Network網(wǎng)絡(luò)分析、Hub蛋白分析等方法，闡明差異蛋白的理化特性和生物信息學(xué)特征。
　?。?）Akt蛋白在Ts65Dn小鼠神經(jīng)元凋亡中的作用研究：收集海馬組織，采用透射電鏡直接觀察Ts65D

6、n小鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡的形態(tài)學(xué)改變；采用TUNEL方法觀察Ts65Dn小鼠海馬神經(jīng)元的凋亡比率；分別采用免疫組化技術(shù)與Western blot技術(shù)觀察Ts65Dn小鼠海馬組織Akt蛋白及其磷酸化（p-Akt）的表達(dá)；從新生Ts65Dn小鼠腦組織分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞；采用LY294002抑制Akt蛋白磷酸活化，阻斷PI3K/Akt通路，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況，初步證實Akt蛋白的異常表達(dá)與Ts65

7、Dn小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　?。?）Ts65Dn母鼠交配繁殖后，第一代子鼠存活17只，按照J(rèn)ackson Laboratory推薦的基因型鑒定方法進(jìn)行型別鑒定。采用iTRAQ技術(shù)，經(jīng)Mascot查庫和Proteome Discoverer定量分析，Ts65Dn小鼠海馬組織中共篩選鑒定到2805種蛋白質(zhì)。通過與正常小鼠比較進(jìn)行顯著性分析并計算其顯著性指數(shù)，共鑒定到顯著性表達(dá)差異的蛋白共374個，其中顯著升高的蛋

8、白有195個，表達(dá)顯著降低的有179個。
　?。?）利用生物信息學(xué)方法對差異蛋白進(jìn)分析。其中GO分析發(fā)現(xiàn)：分子功能類別以結(jié)合蛋白（334，89.3％）、催化活性的蛋白質(zhì)（102，27.3％）和轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)（39，10.4％）數(shù)量最多；生物學(xué)途徑以細(xì)胞途徑（238，63.6％）、生物調(diào)節(jié)途徑（149，39.8％）和代謝途徑（148，39.6%）為主；細(xì)胞學(xué)組件大多數(shù)是細(xì)胞質(zhì)、胞外區(qū)、細(xì)胞膜成分。KEGG分析Ts65Dn小鼠海馬中37

9、4個差異蛋白共有143個蛋白質(zhì)對應(yīng)到144個不同的KEGG通路，經(jīng)FDR矯正取P<0.05統(tǒng)計分析，Akt蛋白所在通路顯著性富集。
　　（3）Ts65Dn小鼠海馬組織神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度的凋亡改變。透射電鏡發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡改變，核膜變薄并輕度下陷、染色體分布不均、核呈固縮性改變、細(xì)胞壁凹陷等。TUNEL結(jié)果顯示Ts65Dn小鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡的陽性表現(xiàn)為細(xì)胞漿、細(xì)胞核呈棕黃色，與正常小鼠相比，神經(jīng)元凋亡率顯著增加。
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10、4）免疫組化與Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ts65Dn與正常小鼠中樞神經(jīng)組織錐體細(xì)胞均有Akt蛋白的表達(dá)，與正常小鼠相比，Ts65Dn小鼠中Akt蛋白顯著增高，p-Akt蛋白的表達(dá)也顯著增強(qiáng)。從新生Ts65Dn小鼠腦組織成功分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元，加入LY294002抑制劑培養(yǎng)48h后，Akt磷酸活化被抑制，p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低，神經(jīng)元凋亡率有降低的趨勢。
　　結(jié)論:
　?。?）采用蛋白組學(xué)