細菌脂多糖通過TLR-4通路抑制小鼠成骨細胞分化及基質(zhì)礦化的分子機制研究.pdf

1、目的:
　　(1)培養(yǎng)小鼠成骨細胞系MC3T3-E1。
　　(2)用不同濃度的脂多糖培養(yǎng)小鼠成骨細胞系MC3T3-E1，利用免疫蛋白印跡測量TLR-4蛋白水平。
　　(3)用逆轉(zhuǎn)錄-PCR的方法測量，不同濃度劑量的脂多糖處理小鼠成骨細胞系MC3T3-E1中成骨標志物ALP, OCN and Runx2的mRNA水平的變化，從而分析脂多糖對于成骨細胞成骨功能影響的計量依賴性。
　　(4)用不同濃度劑量的脂多糖作用于

2、小鼠成骨細胞系MC3T3-E1，檢測成骨細胞中堿性磷酸酶活性和基質(zhì)骨化的計量依賴性，從而分析不同濃度的脂多糖對于成骨細胞，成骨作用的影響。
　　(5)不同濃度的脂多糖作用于去除siRNA-TLR-4表達（對TLR-4特異的siRNA轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細胞）小鼠成骨細胞進行培養(yǎng)，利用Von Kossa法測量基質(zhì)骨化程度，檢測堿性磷酸酶的活性，并測量不同劑量的脂多糖對基因敲除成骨細胞細胞活性和凋亡的影響。
　　方法:
　

3、　(1)細胞系、組織、處理方法。
　　小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞用ATCC配方Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。細胞溶液中添加10％的胎牛血清，100 units/mL的青霉素和100 mg/mL的鏈霉素，放在5％ CO2，37℃的加濕培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。脂多糖(LPS)用苯酚從大腸桿菌0111:B4提取純化，并溶解在含2％血清α-MEM溶液中。設置脂多糖干擾組時，用0

4、，50，100，200，or400ng/mL脂多糖分別培養(yǎng)濃度為85％的成骨細胞0，4，8，12，or24h，為敲除TLR-4表達，將30or60nMsiRNA-TLR-4脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到成骨細胞，用任意序列的RNA作對照。
　　(2)蛋白印跡分析。
　　細胞漿的蛋白用細胞裂解液提取，并輔以蛋白酶抑制劑。蛋白樣品經(jīng)12％SDS-PAGE凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚乙二烯硝酸纖維素膜上。然后非特異性結(jié)合位點的被5％脫脂牛奶阻斷

5、并在4℃過夜，然后用TLR-4的兔多克隆抗體或a磷酸甘油醛脫氫酶在室溫下孵育2h，然后接種用過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體在室溫下封閉1h。最后，用化學免疫發(fā)光(ECL)檢測系統(tǒng)檢測特異性結(jié)合。TLR-4水平用其與GAPDH相對灰度值表示。
　　(3)Von Kossa染色和堿性磷酸酶活性的測定。
　　將細胞在含10％胎牛血清α-MEM中培養(yǎng)并用0、50、200或400ng/ml的脂多糖干擾。用Von Kossa染色法測量M

6、C3T3-E1細胞基質(zhì)礦化水平。通過堿性磷酸酶實驗測量堿性磷酸酶的活性，將MC3T3-E1細胞碎裂，用2毫克蛋白濃度的細胞裂解液加入到測定緩沖液（1 mM氯化鎂，50 mM Tris-HCl，pH9.2）（同時加入2 mM磷酸對硝基苯酚）在37℃孵育10min后，再用0.45 MNaOH終止，在420 nm處用對硝基苯酚處理后，測量吸光度。用與對照組相比較相對值來表示堿性磷酸酶活性檢測的結(jié)果
　　(4)實時反轉(zhuǎn)錄PCR測量TLR-

7、4，ALP, OCN和Runx2的水平。
　　用mRNA Isolation and Purification試劑盒從細胞中分離總mRNA，取1μgmRNA，用one-step SYBR Green PCR Kits試劑盒合成檢測與TLR-4，ALP, OCN和Runx2配對鏈。聚合酶鏈式反應(PCR) TLR-4，ALP, OCN和Runx2的配對鏈的合成后將與分離的mRNA溶液混合，利用LightCycler2.0系統(tǒng)進行檢測

8、。所有實驗均重復三次。用甘油醛-3磷酸脫氫酶做參照，基因轉(zhuǎn)錄水平的相對量用2-△△ct法測定。
　　(5) MTT細胞活性檢測。
　　將MC3T3-E1細胞分別放在含有0、50、100，200或400 ng/ml的脂多糖溶液中培養(yǎng)24h。同時設有空白對照組。加入20μL終濃度為5 mg/mL的MTT，將細胞置于37℃培養(yǎng)4h。之后小心移除上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，放置于搖床上震蕩10分鐘，充分溶解結(jié)晶，用移液器反復

9、吹吸使晶體溶解。培養(yǎng)板放于37℃培養(yǎng)，溶解氣泡后，用全自動定量繪圖酶標儀(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)在570nm波長下測定，結(jié)果計算公式為（實驗孔的A570）/（對照孔的A570）×100％。
　　(6)細胞凋亡檢測。
　　用AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，分析細胞凋亡的百分率。用MC3T3-E1細胞處理過的細胞在2000rpm下離心5min，然后用PBS洗滌兩次

10、，吸取250ul的2×Binding Buffer和250ul去離子水，混勻，接著將細胞懸浮于400μl1×Binding的緩沖液中，使?jié)舛葹?×105 cells/mL，再加入5μL AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶，上下顛倒混勻。處理過的細胞放于暗室進行5-15min放射處理，然后進行流動細胞計數(shù)分析，流式細胞儀參數(shù)調(diào)節(jié)(EX=488nmEm=530nm)檢測細胞凋亡的情況，綠色銀光采用FITC通道通常為FL2來檢測，紅色熒光通

11、過P1通道一般為FL1來檢測。
　　結(jié)果：
　　(1)脂多糖能夠促進小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞生成TLR-4。
　　小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞分別于0、50、100、200或400ng/mL的脂多糖共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，mRNA TLR-4的水平會隨著脂多糖的計量的增大而升高，說明mRNA TLR-4與脂多糖呈計量依賴性，同時還驗證了mRNA TLR-4的水平與處理時間的相關性，由實驗結(jié)果得出小鼠成骨細胞MC3T3-

12、E1細胞TLR-4 mRNA的水平在用200ng/mL脂多糖共培養(yǎng)4h后迅速提高，培養(yǎng)6h和8h，TLR-4 mRNA的水平維持到一定的高值，其中培養(yǎng)8h后達到峰值，與培養(yǎng)4h和6h組比較，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　(2)LPS抑制成骨細胞堿性磷酸酶活性和基質(zhì)骨化。
　　用0、50、100、200或400ng/ml的脂多糖處理成骨細胞MC3T3-E1，其細胞的堿性磷酸酶活性顯著降低，不同濃度組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.0

13、5，P＜0.01，P＜0.001)，且呈劑量依賴性(P＜0.05)，用0、50、100、200或400ng/ml的脂多糖處理成骨細胞MC3T3-E1，其細胞的基質(zhì)骨化水平顯著降低，不同濃度組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001),且呈劑量依賴性(P＜0.05)，當200或400ng/mL脂多糖加入到MC3T3-E1成骨細胞培養(yǎng)，成骨細胞MC3T3-E1形成礦化點明顯減少（P＜0.01200 ng/ml的LPS

14、或P＜0.001400 ng/ml的LPS，圖2C），呈劑量依賴性(P＜0.01)。
　　(3)LPS對成骨細胞成骨標志物的影響。
　　隨著脂多糖濃度的提高，成骨細胞骨鈣素水平顯著性下降，其不同劑量組間差異具有統(tǒng)計學意義。尤其是當濃度大于200ng/ml時，骨鈣素水平顯著性下降，當濃度大于400ng/ml時，骨鈣素水平最低。研究發(fā)現(xiàn)Runx2水平與脂多糖計量關系是:隨著脂多糖濃度的提高，成骨細胞骨Runx2的骨化點顯著性下降

15、，其不同劑量組間差異具有統(tǒng)計學意義。尤其是當濃度大于200ng/ml時，骨化水平顯著性下降，當濃度大于400ng/ml時，固化點水平最低。
　　(4)脂多糖對于核糖核酸干擾介導，敲除TLR-4成骨細胞分化的影響。
　　通過TLR-4-specific siRNAs轉(zhuǎn)染小鼠成骨細胞MC3T3-E1后，成骨細胞TLR-4的表達顯著性降低，基質(zhì)骨化的水平顯著性升高，骨鈣素和OCN的水平也顯著性的高于對照組，經(jīng)統(tǒng)計學比較，差異具有統(tǒng)

16、計學意義，p=0.012本部分從遺傳學基因水平證實了TLR-4為脂多糖誘導成骨細胞分化的作用靶點。
　　結(jié)論：
　　(1)成功培養(yǎng)小鼠成骨細胞系MC3T3-E1。
　　(2)脂多糖促進了成骨細胞MC3T3-E1 TLR-4蛋白表達，且呈計量和時間的相關性。
　　(3)用逆轉(zhuǎn)錄-PCR的方法測量，不同濃度劑量的脂多糖處理的成骨細胞系MC3T3-E1中成骨標志物堿性磷酸酶、骨鈣素、Runx2的變化，脂多糖對于成骨細胞

17、三種成骨功能標志影響存在計量依賴性，呈負相關。
　　(4)用不同濃度劑量的脂多糖作用于成骨細胞系MC3T3-E1，檢測成骨細胞中堿性磷酸酶活性和基質(zhì)骨化的計量依賴性，同時測量了不同劑量對成骨細胞凋亡和活性的影響，脂多糖對于成骨細胞，成骨作用具有抑制反應，同時可以降低成骨細胞活性提高成骨細胞凋亡的比例。
　　(5)敲除TLR-4的成骨細胞MC3T3-E1其基質(zhì)骨化程度和堿性磷酸酶、OCN、Runx2的mRNA水平增高，敲除TL