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文檔簡(jiǎn)介
1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是全世界因心血管疾病導(dǎo)致死亡的主要原因。研究認(rèn)為,動(dòng)脈粥樣硬化是由多種炎癥因子參與的慢性炎癥反應(yīng)過(guò)程,涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、血小板功能改變等,并能最終導(dǎo)致斑塊破裂,血栓形成。而諸多的心血管危險(xiǎn)因素可造成內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷,并成為動(dòng)脈硬化發(fā)展的關(guān)鍵始動(dòng)環(huán)節(jié)。據(jù)報(bào)道,硅化物是防治心血管系統(tǒng)疾病的有效成分并能維持血管壁的彈性。本實(shí)驗(yàn)室以往研究證實(shí)Na2SiO3能減輕家兔
2、動(dòng)脈硬化程度。NADPH氧化酶4(NADPH oxidative enzyme4,Nox4)是血管活性氧(Reactive OxygenSpecies,ROS)生成最重要的來(lái)源,ROS可直接激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)或其他途徑間接使NF-κB活化,從而引起一系列炎癥因子的改變,進(jìn)而影響血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)及功能。有研究表明,內(nèi)源性ROS能通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB的激活,繼而引起單核細(xì)胞趨化蛋白-1(mono
3、cyte chemoattractant protein-1,MCP-1)表達(dá)的增加。
本實(shí)驗(yàn)主要從氧化應(yīng)激-炎癥通路探討Na2SiO3是否通過(guò)Nox4/NF-κB通路發(fā)揮抑制高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷的作用。
目的:
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)喂養(yǎng)高脂飼料聯(lián)合注射維生素D3建立動(dòng)物模型,研究Na2SiO3防治高脂飼料喂養(yǎng)大鼠血管內(nèi)膜損傷的作用機(jī)制。通過(guò)觀察血清中指標(biāo),組織形態(tài)學(xué)改變,判斷Na2SiO3對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)
4、大鼠血脂及血管內(nèi)膜損傷的影響。利用免疫組化與分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)NF-κB-p65、Nox4和MCP-1的水平等指標(biāo),探討Na2SiO3防治高脂飼料喂養(yǎng)大鼠血管內(nèi)膜損傷的潛在機(jī)制。
方法:
清潔級(jí)雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠隨機(jī)分成5組(n=7),分別為:對(duì)照組、模型組、低硅組(Na2SiO35mg/kg)、高硅組(Na2SiO310mg/kg)和他汀組(5mg/kg)。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,模型組和藥物干
5、預(yù)組一次性腹腔注射維生素D3(60萬(wàn)IU/kg),同時(shí)開(kāi)始以高脂飼料喂養(yǎng),并于實(shí)驗(yàn)第4周再次腹腔注射維生素D330萬(wàn)IU/kg(隔天一次,分3次注射)。低硅組、高硅組分別給予不同劑量濃度(5mg/kg,10mg/kg)的Na2SiO3溶液灌胃,他汀組給予辛伐他汀(5mg/kg)灌胃,對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃,實(shí)驗(yàn)持續(xù)10周。實(shí)驗(yàn)最后禁食24h,稱重后用3%水合氯醛麻醉,取血,沿脊柱分離主動(dòng)脈;取1×1cm大小的肝組織。主動(dòng)脈
6、及肝臟都分為兩份,一份于4%的多聚甲醛溶液中固定,另一份組織迅速置于液氮,隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存。
采用生物化學(xué)技術(shù)檢測(cè)血清中TG、TC、LDL、HDL的含量。對(duì)大鼠肝和主動(dòng)脈組織進(jìn)行HE染色。利用免疫組化和westem blot方法測(cè)定大鼠腹主動(dòng)脈組織Nox4、NF-κB-p65蛋白水平,RT-PCR和western blot方法檢測(cè)MCP-1蛋白和mRNA的表達(dá)。
結(jié)果:
1.Na2SiO3對(duì)高脂飼
7、料喂養(yǎng)的大鼠血清TG、TC、LDL、HDL水平的影響
血清檢測(cè)結(jié)果顯示,模型組大鼠的TG相比于對(duì)照組,有明顯升高;低硅、高硅組與模型組相比均無(wú)明顯降低;他汀組與模型組相比有顯著降低。
模型組大鼠的血清TC相比于對(duì)照組,有顯著升高;與模型組相比,低硅、高硅、他汀組均有明顯降低。
模型組大鼠血清LDL與對(duì)照組相比,有顯著升高;與模型組相比,低硅、高硅、他汀組血清LDL均顯著降低。
模型組大鼠血清HDL
8、與對(duì)照組相比明顯升高,與模型組相比,低硅組血清HDL未明顯降低;高硅、他汀組血清HDL均明顯降低。
2.Na2SiO3對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)大鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響
HE結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)較多的空泡變性;與模型組相比,不同劑量硅組、他汀組肝細(xì)胞空泡變性數(shù)目減少。
3.Na2SiO3對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)的影響
HE結(jié)果顯示,與正常組血管相比,模型組血管內(nèi)膜明顯增厚,動(dòng)脈中
9、層平滑肌細(xì)胞排列紊亂,局部有鈣化;低硅組血管內(nèi)膜排列較整齊,內(nèi)膜局部輕微增生;高硅組血管內(nèi)膜光滑平整,無(wú)增厚,中層平滑肌細(xì)胞排列整齊;他汀組血管內(nèi)膜較光滑。
4.Na2SiO3對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈組織Nox4的蛋白表達(dá)影響
免疫組化結(jié)果顯示,在正常組的血管組織中,血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞的Nox4表達(dá)較少;模型組Nox4表達(dá)升高;低硅、高硅及他汀組相比于模型組都有不同程度的降低。
Western blot結(jié)
10、果顯示,對(duì)照組Nox4的蛋白表達(dá)量較少;模型組蛋白表達(dá)明顯增加;而不同劑量硅組的Nox4的蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)。
5.Na2SiO3對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈組織NF-κB-p65蛋白表達(dá)與活化影響
免疫組化結(jié)果顯示,對(duì)照組中NF-κB-p65呈彌散分布在細(xì)胞質(zhì)中;模型組中NF-κB-p65表達(dá)明顯增加,并主要分布于細(xì)胞核內(nèi);不同劑量硅組和他汀組的血管組織中NF-κB-p65的表達(dá)較少。
Western blo
11、t結(jié)果顯示,對(duì)照組NF-κB-p65的蛋白表達(dá)量較少;模型組NF-κB-p65總蛋白和核蛋白水平均明顯增加;不同劑量硅組和他汀組NF-κB-p65總蛋白和核蛋白水平均明顯下降。
6.Na2SiO3對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈組織MCP-1蛋白及mRNA水平的影響
Western blot結(jié)果顯示,對(duì)照組MCP-1的蛋白表達(dá)量較少;模型組蛋白表達(dá)明顯增加;而低硅、高硅、他汀組MCP-1的蛋白表達(dá)量明顯下降。
RT
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