表觀遺傳調(diào)控對骨癌痛大鼠痛覺過敏與認(rèn)知障礙以及BDNF介導(dǎo)的突觸可塑性的影響.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 腰硬聯(lián)合穿刺技術(shù)用于改良大鼠鞘內(nèi)置管術(shù)
　　目的:
　　大鼠鞘內(nèi)置管與給藥技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)和疼痛研究中是一項(xiàng)重要的實(shí)驗(yàn)方法。該技術(shù)自被報(bào)道以來不斷被加以改進(jìn)，但是多年來經(jīng)驗(yàn)提示仍然有許多缺陷未被有效解決。
　　方法:
　　我們通過對標(biāo)準(zhǔn)硬膜外穿刺針和腰麻穿刺針進(jìn)行簡單改造，開發(fā)出一種類似腰硬聯(lián)合麻醉“針中針”技術(shù)的大鼠鞘內(nèi)置管方法。首先通過腰部皮膚切口將硬膜外針插

2、入皮下，頂端抵達(dá)椎間孔;然后在硬膜外針中插入腰麻針，并在黃韌帶和珠網(wǎng)膜上鉆孔;最后通過硬膜外針體上的側(cè)孔將PE-10導(dǎo)管置入蛛網(wǎng)膜下腔。為了與傳統(tǒng)置管方法比較，椎板切除法（對照組）或我們的改良技術(shù)（改良組）被用于大鼠鞘內(nèi)置管。記錄兩組手術(shù)時(shí)間、成功率及術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率。分別在術(shù)前1天和術(shù)后第1～3和5、7、14、21天測量大鼠熱縮爪潛伏期、機(jī)械縮爪閾值和運(yùn)動(dòng)功能變化，以評估鞘內(nèi)置管對神經(jīng)功能的影響。
　　結(jié)果:
　　我們的

3、改良方法與椎板切除法相比，更加簡單方便，具有較少的手術(shù)創(chuàng)傷，較好的位置精確性，更牢固的導(dǎo)管固定，較小的死亡率。手術(shù)本身沒有干擾行大鼠神經(jīng)行為學(xué)和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)。
　　結(jié)論:
　　該改良鞘內(nèi)置管方法可較好地用于有關(guān)脊髓部位的神經(jīng)行為學(xué)和藥理學(xué)研究。
　　第二部分 HDAC和HAT抑制劑對骨癌痛大鼠痛覺過敏和BDNF介導(dǎo)的突觸可塑性的影響
　　目的:
　　癌性疼痛對癌癥患者產(chǎn)生不利影響，在臨床上通常很難得到有效治療。

4、我們的既往研究表明，從脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)對于骨癌接種誘導(dǎo)的大鼠痛覺過敏是必需的。BDNF是一個(gè)重要的表觀遺傳靶基因，受組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)酶之間平衡的調(diào)節(jié)。BDNF的組蛋白乙酰化調(diào)控在骨癌痛發(fā)生發(fā)展中的作用還知之甚少。因此，本研究的目標(biāo)是探討HAT抑制劑-姜黃素(CUR)和HDAC抑制劑-辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)對痛行為學(xué)和脊髓背角BDNF和突觸素1(SYN1)表

5、達(dá)的影響。
　　方法:
　　40只雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組:對照組、骨癌痛+溶媒組、骨癌痛+SAHA25μg組、骨癌痛+SAHA5μg組、骨癌痛+SAHA1μg組。大鼠左脛骨上端注入Walker256細(xì)胞制備骨癌痛模型。建模后第6～8天，SAHA各劑量組大鼠分別鞘內(nèi)注射相應(yīng)劑量的SAHA;溶媒組鞘內(nèi)注射5％ DMSO20μl。分別于術(shù)前及術(shù)后第1～18天測定大鼠機(jī)械縮足閾值(PWT)。另取32只雌性SD大鼠隨機(jī)分為4組:假手

6、術(shù)對照組(SHAM)、骨癌痛+溶媒組(VEH)、骨癌痛+SAHA組(SAHA)、骨癌痛+CUR組(CUR)。在大鼠建模后第6～8天，SAHA組大鼠腹腔注射SAHA50mg/kg，CUR組大鼠腹腔注射CUR50mg/kg，VEH組大鼠腹腔注射相同容量的DMSO，1次/天，連續(xù)3天。機(jī)械痛閾值測定同前。另取48只雌性大鼠，分組和處理同前。在造模后第9天，各組分別取4只大鼠進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色、Western blots和Real-timeP

7、CR實(shí)驗(yàn)以檢測BDNF、SYN1、acH3K9和acH4K16在脊髓組織表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　造模后6-18天，大鼠機(jī)械痛閾值顯著降低。鞘內(nèi)注射不同劑量的SAHA組呈劑量依賴性地提高PWT值。免疫熒光雙標(biāo)顯示BDNF分別與神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)，而ACH3k9、ACH4k16和SYN1只存在于神經(jīng)元。接種后6～8天連續(xù)腹腔注射SAHA能夠逆轉(zhuǎn)BCP誘導(dǎo)的機(jī)械痛敏，增加H3K9和H4k16的乙?；瑴p少脊髓背角BDNF/S

8、YN1的表達(dá)。應(yīng)用CUR對大鼠機(jī)械痛閾和BDNF/SYN1表達(dá)沒有顯著影響。
　　結(jié)論:
　　HDAC抑制劑以一種間接的方式下調(diào)骨癌痛大鼠脊髓BDNF/SYN1表達(dá)，而發(fā)揮抗痛覺過敏作用。
　　第三部分 表觀遺傳調(diào)控對骨癌痛大鼠認(rèn)知障礙和海馬組織BDNF/SYN1表達(dá)的影響
　　目的:
　　既往研究表明，長期慢性疼痛刺激通過下調(diào)BDNF表達(dá)對學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生顯著影響。BDNF是一個(gè)重要的表觀遺傳調(diào)控靶基因。本研

9、究采用大鼠骨癌痛動(dòng)物模型，觀察HAT抑制劑-姜黃素(CUR)和HDAC抑制劑-辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)治療對骨癌接種后認(rèn)知功能和海馬組織BDNF/SYN1表達(dá)的影響，旨在為預(yù)防癌痛誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　28只雌性SD大鼠隨機(jī)分為7組:正常對照組、假手術(shù)組和造模后第3、6、12、18天組。于大鼠左脛骨上端注入Walker256細(xì)胞制備骨癌痛模型。Western blots檢測每個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬組織

10、BDNF/SYN1表達(dá)量。另取4只大鼠在造模后第12天組行BDNF、SYN1、acH3k9和acH4K16分別與神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物(GFAP、OX42、NeuN)的免疫熒光雙標(biāo)染色。另有32只雌性SD大鼠隨機(jī)分為4組:假手術(shù)對照組(SHAM)、骨癌痛+溶媒組(VEH)、骨癌痛+SAHA組(SAHA)、骨癌痛+CUR組(CUR)。在造模后第10～13天，VEH組、SAHA組和CUR組分別腹腔注射相應(yīng)的藥物，1次/天，連續(xù)4天。Morris水迷

11、宮實(shí)驗(yàn)和神經(jīng)認(rèn)知功能評分被用來測量大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。Western blots或Real-time PCR用來檢測海馬組織BDNF/SYN1表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　海馬SYN1/BDNF在造模后3天有一個(gè)升高的過程，之后則迅速下降。免疫熒光結(jié)果顯示，海馬組織BDNF和acH3K9主要分布于小膠質(zhì)細(xì)胞。在造模后第11～13天（水迷宮實(shí)驗(yàn)第2～4天），VEH組大鼠隱藏平臺(tái)潛伏期和游泳距離平均值與SHAM組相比顯著延長。連續(xù)4