不同來源BM-MSCs對脫髓鞘模型髓鞘修復(fù)及情感障礙影響及機制的初步研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)的髓鞘是由少突膠質(zhì)細(xì)胞的片狀突起包繞神經(jīng)元軸突而形成的具有保護軸索、傳導(dǎo)神經(jīng)沖動和絕緣等作用的螺旋形膜性結(jié)構(gòu)。多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種自身免疫性疾病，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特點，好發(fā)于中青年，病變多發(fā)導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損大，從而引起不同程度的生理和心理障礙，且每況愈下，致殘率極高，使MS患者的身心均受到巨大重創(chuàng)，極易引起精神

2、癥狀，多表現(xiàn)為抑郁、焦慮和易怒等，其生活質(zhì)量嚴(yán)重受損，并影響患者對治療的依從性，故MS合并焦慮抑郁障礙越來越受到學(xué)術(shù)界及臨床醫(yī)生的重視。大量研究表明MS合并焦慮抑郁的機制有腦萎縮、炎癥因子的作用、藥物影響、認(rèn)知障礙和社會心理因素引起。目前，MS的臨床治療以糖皮質(zhì)激素、大劑量免疫球蛋白、β-干擾素及免疫抑制劑為主，MS并發(fā)焦慮抑郁障礙的臨床治療方法包括抗焦慮抑郁藥物和心理行為治療等對癥治療。故如何促進髓鞘再生和功能修復(fù)及逆轉(zhuǎn)疾病的進程是M

3、S合并焦慮抑郁障礙治療的關(guān)鍵點。
　　目前，干細(xì)胞移植是再生醫(yī)學(xué)研究中最有希望的方法之一，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrowed-mesenchymal stem cells，BM-MSCs)以其獨特的生物學(xué)特性和臨床應(yīng)用前景成為近來研究的熱點。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是不同于骨髓造血干細(xì)胞的一類多能干細(xì)胞群，具有體外易獲得、增殖力強、多向分化潛能、表面抗原不明顯等特點，多次傳代后仍保持干細(xì)胞特性，且移植到體內(nèi)免疫排斥反應(yīng)弱，它的

4、這些生物學(xué)特性使其應(yīng)用于自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液病、骨與軟骨疾病、肝衰竭等疾病的治療研究中。大量實驗研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對多發(fā)性硬化有治療作用，但其作用機制尚存在爭議，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為這主要是通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答實現(xiàn)。
　　目前關(guān)于BM-MSCs移植治療的爭議之一是BM-MSCs自體移植與異體移植哪一個更好？BM-MSCs體外擴增后進行自體移植，可避免組織配型、免疫排斥和醫(yī)學(xué)倫理方面的問題，然而重要的是要考慮到患者自體的骨

5、髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否也受到病理環(huán)境的影響，從而降低其治療疾病的效果。另一方面，從理論上來說，BM-MSCs具有免疫原性低和免疫負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可誘導(dǎo)同種異體移植的免疫耐受作用，通過同種異體移植在組織再生和功能修復(fù)中發(fā)揮重要作用。但有關(guān)不同來源的BM-MSCs對MS的髓鞘修復(fù)作用的對比研究，鮮有報道。雙環(huán)己酮草酰二腙(Cuprizone，CPZ)是一種選擇性銅離子螯合劑，小劑量能夠靶向損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體，使形成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡，誘

6、導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘脫失，常作為誘導(dǎo)因子建立脫髓鞘動物模型。CPZ誘導(dǎo)的脫髓鞘模型與實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型（Experimental allergicencephalopalomyelitis，EAE）最大的不同在于其誘導(dǎo)模型的過程中不涉及免疫系統(tǒng)的復(fù)雜反應(yīng)，并且有部分學(xué)者將CPZ誘導(dǎo)的慢性脫髓鞘模型作為精神障礙的相關(guān)模型。
　　因此，我們擬采用CPZ誘導(dǎo)的小鼠慢性脫髓鞘模型，應(yīng)用免疫組化、分子生物學(xué)、病理學(xué)及動物行為學(xué)研究等

7、方法，首先觀察正常小鼠BM-MSCs對CPZ誘導(dǎo)的小鼠慢性脫髓鞘模型修復(fù)作用及其焦慮抑郁的影響，同時觀察實驗小鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)變化，進而比較不同來源BM-MSCs對模型小鼠髓鞘的修復(fù)作用影響，初步探明哪一種來源的BM-MSCs對模型小鼠髓鞘的修復(fù)作用更好，并從分泌蛋白組學(xué)初步探討產(chǎn)生修復(fù)差異的機制，為臨床MS患者BM-MSCs治療提供一定理論依據(jù)。
　　第一部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對Cuprizone誘導(dǎo)的脫髓鞘小鼠模型髓鞘修復(fù)和情緒

8、影響的實驗研究
　　方法：
　　1.1選取8周齡C57BL/6雄性小鼠70只，分為正常對照組和實驗組，實驗組又分為慢性脫髓鞘組、髓鞘修復(fù)組和細(xì)胞治療組。正常對照組喂養(yǎng)正常鼠糧14周，實驗組連續(xù)喂養(yǎng)CPZ鼠糧12周后，髓鞘修復(fù)組和細(xì)胞治療組改為喂養(yǎng)正常鼠糧2周，同時在誘導(dǎo)第13周時對細(xì)胞治療組進行BM-MSCs細(xì)胞注射，慢性脫髓鞘組則繼續(xù)喂養(yǎng)CPZ鼠糧。
　　1.2運用全骨髓培養(yǎng)法及密度梯度離心法從幼年C57BL/6小鼠

9、的骨髓中提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進行培養(yǎng)、鑒定、移植。
　　1.3每周測量2次體重，觀察并記錄各組小鼠的體重變化。
　　1.4通過曠場試驗、高架十字迷宮實驗及懸尾實驗檢測各組小鼠的行為學(xué)變化。
　　1.5采用盧卡斯快藍染色、MBP免疫熒光染色及電鏡技術(shù)觀察各組小鼠腦組織胼胝體區(qū)的髓鞘脫失情況。GFAP免疫熒光染色測量胼胝體區(qū)及皮質(zhì)區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化。
　　1.6利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和高效液相色譜-電化

10、學(xué)檢測法（HPLC-ECD）測定各組小鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的濃度。
　　結(jié)果：
　　2.1原代BM-MSCs培養(yǎng)24-48小時即可貼壁。培養(yǎng)至第2代時對其細(xì)胞表型標(biāo)記CD29、CD90進行免疫熒光染色，可見陽性率可達90％以上，待模型誘導(dǎo)完成后進行細(xì)胞移植發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs可遷移至腦組織脫髓鞘區(qū)。
　　2.2與正常對照組比較，實驗組前期體重上升緩慢，喂養(yǎng)至15周可見銹鞘修復(fù)組(29.93±2.74)g與細(xì)胞治療

11、組（32.33±2.96）g小鼠的體重明顯升高，且與慢性脫髓鞘組（27.98±3.31）g比較，正常對照組（33.85±1.70）g及細(xì)胞治療組小鼠的體重差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.3行為學(xué)實驗顯示:曠場實驗中的中央路程比及高架十字迷宮實驗開臂滯留時間百分比(OT％)及開臂進入次數(shù)百分比(OE％)反映實驗小鼠的焦慮行為，懸尾實驗的不動時間反映小鼠的抑郁行為，可見慢性脫髓鞘組小鼠的中央路程比（0.07±0.03）

12、，OT為（15.50±5.03）％，OE為(14.10±6.54)％，不動時間為(170.08±21.69)s;正常對照組小鼠的中央路程比為（0.12±0.03），OT為(25.92±5.43)％，OE為(31.33±5.69)％，不動時間為（121.33±38.66）s;與正常對照組比較，慢性脫髓鞘組小鼠表現(xiàn)出明顯的焦慮抑郁行為(P＜0.05);經(jīng)過細(xì)胞治療后，細(xì)胞治療組小鼠的中央路程比為(0.11±0.04)，OT為（21.64±3

13、.42）％，OE為（26.54±6.49）％，不動時間為（134.67±37.49）s，與慢性脫髓鞘組比較其焦慮抑郁行為有明顯改善(P＜0.05)。
　　2.4通過對各組小鼠腦組織胼胝體區(qū)域的MBP、LFB染色及電鏡檢測可見，與正常對照組小鼠腦組織染色OD值（0.29±0.09）相比，慢性脫髓鞘組小鼠胼胝體區(qū)域髓鞘脫失明顯（0.14±0.07）(P＜0.01)，而細(xì)胞治療組（0.25±0.08）及髓鞘修復(fù)組(0.21±0.09)較

14、慢性脫髓鞘組的髓鞘有所修復(fù)(P＜0.05)，且細(xì)胞治療組較髓鞘修復(fù)組胼胝體區(qū)髓鞘修復(fù)效果更明顯(P＜0.05)。采用GFAP免疫熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)，慢性脫髓鞘組較正常對照組小鼠胼胝體區(qū)（78.12±15.47）V.S（21.56±10.63）及皮層區(qū)(101.15±23.30)V.S(34.67±12.25)星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量明顯升高(P＜0.01)，然而細(xì)胞治療組小鼠胼胝體區(qū)（59.07±25.36）及皮層區(qū)（41.11±17.42）G

15、FAP的表達比慢性脫髓鞘組及髓鞘修復(fù)組有所下降(P＜0.05)。
　　2.5利用HPLC-ECD測得正常對照組小鼠血清NE、5-HT和5-HIAA的濃度分別為1.32±0.92ng/L、126.04±22.43ng/L、27.26±3.17ng/L，慢性脫髓鞘組依次為2.82±1.01ng/L、159.68±23.06ng/L、43.89±6.59ng/L，兩組在血清NE、5-HT和5-HIAA濃度差異顯著(P＜0.05)，與慢性

16、脫髓鞘組相比，細(xì)胞治療組小鼠血清5-HT（27.77±5.81ng/L）和(5-HIAA1.10±0.76ng/L)濃度有所降低(P＜0.05)。ELISA顯示:正常對照組與慢性脫髓鞘組小鼠血清NE（23.82±19.65）V.S（50.83±17.64）和5-HT（39.72±19.16）V.S（99.30±29.11）濃度存在差異（P＜0.05），細(xì)胞治療組與慢性脫髓鞘組相比，其小鼠血清NE（25.58±19.33）及5-HT（54

17、.83±18.41）的濃度有下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　從行為學(xué)、病理改變等方面證實CPZ誘導(dǎo)的脫髓鞘模型是可行的。CPZ誘導(dǎo)的脫髓鞘模型小鼠表現(xiàn)出焦慮抑郁樣行為，這可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘脫失以及脫髓鞘環(huán)境下所引起的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化有關(guān);該模型適合作為MS合并焦慮抑郁障礙的實驗載體，BM-MSCs移植能促進脫髓鞘模型的髓鞘修復(fù)及情緒改善。
　　第二部分 不同來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對Cuprizone

18、誘導(dǎo)的小鼠脫髓鞘模型髓鞘修復(fù)作用的對比研究
　　方法：
　　1.1周齡C57BL/6雄性小鼠40只，分為正常對照組和實驗組，實驗組又分為來源于同種干細(xì)胞干預(yù)組組、來源于異種干細(xì)胞干預(yù)組及病理對照組，模型誘導(dǎo)方法及細(xì)胞治療方法同上。
　　1.2采用密度梯度離心法從人的骨髓中提取MSCs，并培養(yǎng)、鑒定及移植。
　　1.3利用細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(CCK-8)檢測Cuprizone藥物對小鼠的MSCs的是否存在毒性

19、作用，比較健康志愿者及MS患者來源的MSCs的增殖能力并判斷是否存在差異。
　　1.4細(xì)胞移植2周后行行為學(xué)及病理學(xué)檢測，以比較不同來源MSCs對髓鞘修復(fù)及功能恢復(fù)能力是否存在差異。
　　1.5通過蛋白免疫印跡技術(shù)(WB)對細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞內(nèi)的肝細(xì)胞生長因子(HGF)進行定量分析。
　　結(jié)果：
　　2.1人骨髓提取的原代BM-MSCs培養(yǎng)48-72小時可貼壁。10-14天后即可傳代，傳至第2代時經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測

20、其表型，可見表達CD90陽性的細(xì)胞比例為99.12％，CD105的陽性率為82.41％，CD73為99.94％，表達CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR陽性的細(xì)胞比例為0.34％。
　　2.2通過CCK-8檢測顯示，與來源正常小鼠的BM-MSCs(Norml cells)相比，來源病理組小鼠的BM-MSCs(CPZ cells)增殖能力下降(P＜0.01)，Cuprizone藥物對來源正常小鼠的BM-MSCs的增

21、殖能力無明顯影響;來源健康志愿者及MS患者的BM-MSCs在增殖力方面存在差異(P＜0.01)。
　　2.3細(xì)胞移植2周后對各組小鼠行行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，在曠場實驗中與MS患者來源干細(xì)胞干預(yù)組小鼠總路程（8304.91±1188.34）cm比較，志愿者來源干細(xì)胞干預(yù)組小鼠總路程（（6883.99±1246.70）呈現(xiàn)出運動能力的提升(P＜0.05)。病理學(xué)染色顯示:與來源MS患者干細(xì)胞干預(yù)組（0.19±0.08）相比，來源志愿者干細(xì)胞

22、干預(yù)組小鼠（0.27±0.06）的髓鞘修復(fù)效果更佳(P＜0.05)。來源正常小鼠干細(xì)胞干預(yù)組CC區(qū)及CTX區(qū)活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)為(44.34±10.27)及（52.02±12.02），來源病理組小鼠干細(xì)胞干預(yù)組CC區(qū)及CTX區(qū)為(67.34±11.74)及（72.02±17.53），兩組間差異顯著(P＜0.01);來源志愿者干細(xì)胞干預(yù)組CC區(qū)及CTX區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量為(38.34±12.46)、（47.36±9.69）較來源MS患

23、者干細(xì)胞干預(yù)組CC區(qū)及CTX區(qū)(65.61±12.58)、(86.02±16.14)的數(shù)量明顯減少(P＜0.01)。
　　2.4利用WB對目的蛋白肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)進行檢測發(fā)現(xiàn)，健康來源（小鼠/人）HGF的OD值為（0.40±0.11）（0.37±0.06）比病態(tài)來源（小鼠/人）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清中HGF的OD值（0.33±0.08）（0.28±0.10）高(P＜0.0