人骨髓間充質干細胞介導的肝細胞生長因子拮抗劑NK4地肝癌的體外抑制作用研究.pdf

1、目的:間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSCs)作為重要的成體干細胞之一，免疫原性低，在體內能夠向腫瘤遷移、定位，并整合入腫瘤的結締組織中。干細胞治療是目前正在探索的腫瘤新型生物治療方法之一，以MSCs作為抗腫瘤因子的遞送載體用于腫瘤治療的嘗試已取得一定進展。肝細胞生長因子拮抗劑NK4具有拮抗肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor, HGF）誘導的腫瘤生長、轉移和侵襲以及抑制非HGF/

2、c-Met依賴性的腫瘤血管生成的雙重作用，作為抗腫瘤制劑具有良好的應用前景。目前常用腺病毒作為遞送載體介導其發(fā)揮抗腫瘤作用，以MSCs為遞送載體可以避免腺病毒載體直接遞送基因反復應用引起的免疫排斥反應。本實驗擬通過體外實驗研究人骨髓MSCs向人高轉移肝癌細胞系MHCC-97H的遷移特性以及通過重組腺病毒載體(recombinant adenoviral vector,rAd)介導NK4修飾的人骨髓MSCs對MHCC-97H細胞增殖和轉移

3、的抑制作用及其機制。
　　方法:通過transwell將MSCs與MHCC-97H共培養(yǎng)，分析MSCs體外向肝癌細胞MHCC-97H的遷移性。以pCR-4-TOPO-HGF為模板，PCR擴增獲得NK4基因，然后克隆入穿梭質粒pAdTrack-CMV，再經同源重組獲得重組腺病毒質粒，293細胞包裝，獲得重組腺病毒rAd-NK4/GFP，用TCID50法測定病毒滴度，提取病毒基因組PCR鑒定目的基因，Western-blot鑒定目的基

4、因表達;用高滴度的腺病毒rAd-NK4/GFP感染MSCs，獲得帶有NK4的MSCs(rAd-NK4-MSCs)，將rAd-NK4-MSCs與MHCC-97H以1∶1的比例通過transwell進行共培養(yǎng)，分別在24h、48 h、72 h用MTT法檢測rAd-NK4-MSCs對MHCC-97H細胞增殖的抑制作用，在24 h后用結晶紫染色法檢測rAd-NK4-MSCs對MHCC-97H細胞轉移的抑制作用。為了探究rAd-NK4-MSCs對

5、MHCC-97H增殖和轉移的抑制機制，應用Western-blot檢測MHCC-97H與rAd-NK4-MSCs共培養(yǎng)后MHCC-97H細胞HGF/c-Met信號通路關鍵因子ERK1/2磷酸化水平變化。為了進一步探究rAd-NK4-MSCs也可以通過抑制血管生成來抑制腫瘤生長，利用細胞劃痕實驗檢測了rAd-NK4-MSCs條件培養(yǎng)基對人臍帶血管內皮細胞(HUVECs)體外轉移的抑制作用。
　　結果:MSCs遷移實驗結果表明，體外M

6、SCs具有顯著的向MHCC-97H細胞的遷移性(P＜0.01)。在構建重組腺病毒實驗中，重組腺病毒DNA分子轉染293細胞后，10d左右細胞出現腫脹、圓縮等典型的病變效應（Cytopathic effect，CPE），提取病毒基因組后PCR檢測到目的條帶，Western-blot檢測到NK4基因的表達，擴增后得到高滴度(0.8×1010 pfu/mL)、有活性的非復制型重組腺病毒rAd-NK4/GFP，并成功感染MSCs。體外共培養(yǎng)實驗

7、中，MTT結果表明，在24 h、48 h、72 h時rAd-NK4-MSCs均能顯著抑制MHCC-97H細胞的體外增殖(P＜0.05)，抑制率隨著時間的延長而增大;結晶紫染色實驗結果表明，rAd-NK4-MSCs顯著抑制了MHCC-97H細胞的體外遷移能力(P＜0.01); Western-blot檢測到ERK1/2磷酸化水平下調。HUVECs體外遷移抑制實驗中，rAd-NK4-MSCs條件培養(yǎng)基顯著抑制了HUVECs的體外遷移(P＜0