促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子通過對GSK3β的磷酸化促進U87MG細胞的凋亡.pdf

1、背景：膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的腫瘤，呈浸潤性生長，易侵犯重要的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，預后差，復發(fā)率及死亡率高。雖然外科手術和放化療治療效果都有了極大的提高，但是還遠未達到理想的效果。能否通過生物治療（靶向治療）延長患者生存期，這給我們提供了一個全新的思路。
　　研究表明，提高細胞內(nèi)cAMP水平并激活cAMP依賴的信號轉(zhuǎn)倒途徑能夠促進中樞及外周各種神經(jīng)組織的存活。在CRF作用于小腦顆粒細胞的研究中發(fā)現(xiàn)CRF-CRFR-cAMP-PKA激活

2、，最終導致GSK-3β的磷酸化在神經(jīng)保護作用中發(fā)揮重要作用[1]。GSK3β的生物學功能較復雜，在腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移及凋亡、癌細胞基因轉(zhuǎn)錄、加速細胞周期過程中起到調(diào)控作用。GSK3β在不同遺傳背景的細胞中發(fā)揮不同的作用，所以必須明確特定細胞中GSK3β激活與失活所發(fā)揮的作用才能進一步加以利用。前期實驗研究發(fā)現(xiàn) CRF能促進膠質(zhì)瘤 U87MG凋亡，且凋亡相關蛋白capase-3的表達與細胞凋亡趨勢一致，進一步研究發(fā)現(xiàn) CRF作用于 U87

3、細胞后細胞內(nèi)cAMP及PKA水平明顯升高。CRF作用于兩種細胞后上游信號分子的表達趨勢一致，但是結(jié)果卻完全相反，所以有必要進一步研究CRF作用下U87MG內(nèi)GSK3β的活性狀態(tài)及對細胞凋亡所起的作用。
　　目的：研究CRF作用于人腦膠質(zhì)瘤U87MG細胞后pGSK3β在細胞漿和細胞核的表達情況，探討pGSK3β在CRF促進U87MG細胞凋亡中所起作用。
　　方法：
　　1.免疫熒光顯微鏡檢測正常U87細胞和CRF作用后的

4、細胞內(nèi)pGSK3β是否有表達。
　　2.培養(yǎng)U87細胞，用不同濃度CRF（10-7，10-8，10-9 mol/L）進行干預，干預時間分為12h，24h，36h，每個濃度和時間點都設置相應的對照組。然后應用胞漿/胞核蛋白提取試劑盒分開提取胞漿和胞核蛋白，用western blot檢測細胞漿及細胞核pGSK3β的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.免疫熒光顯微鏡顯示：對照組和實驗組都有pGSK-3β的表達。
　　2.W

5、estern blot檢測細胞漿與細胞核pGSK-3β的結(jié)果顯示：CRF10-7 mol/L組:12h，24h實驗組細胞漿和細胞核pGSK-3β的表達量與對照組無明顯差別（胞漿 Z12h=-1.091， P=0.1375， Z24h=-0.218， P=0.4135，胞核Z12h=-0.655，P=0.2565，Z24h=-0.655，P=0.2565）。36h實驗組細胞漿和細胞核pGSK-3β的表達量明顯高于對照組（胞漿Z36h=-1

6、.964，P=0.025，胞核Z36h=-1.964，P=0.025）。CRF10-8 mol/L組:12h，24h實驗組細胞漿和細胞核 pGSK-3β的表達量與對照組無明顯差別（胞漿 Z12h=-1.107， P=0.134，Z24h=-1.528，P=0.0635，胞核Z12h=-0.655，P=0.2565，Z24h=-1.091， P=0.1375）。36h實驗組細胞漿和細胞核pGSK-3β的表達量明顯高于對照組（胞漿Z36h=

7、-1.964，P=0.025，胞核Z36h=-1.964，P=0.025）。CRF10-9 mol/L組:12h，24h，36h實驗組細胞漿和細胞核pGSK-3β的表達量與對照組無明顯差別（胞漿Z12h=-0.655，P=0.2565，Z24h=-0.218，P=0.4135，Z36h=-0.218， P=0.4135，胞核Z12h=-0.218，P=0.2135，Z24h=-1.091，P=0.1375，Z36h=-1.091， P=

8、0.1375）。
　　3.36h實驗組胞漿和胞核pGSK-3β/36h對照組胞漿和胞核pGSK-3β的統(tǒng)計結(jié)果顯示：CRF10-7 mol/L, CRF10-8 mol/L, CRF10-9 mol/L三組之間存在明顯差別（胞漿 Chi-square實驗組/對照組=7.200， P=0.027，胞核Chi-square實驗組/對照組=7.200，P=0.027）。
　　結(jié)論：
　　1.免疫熒光顯微鏡顯示：U87MG細胞