牛蒡寡糖脂質(zhì)體的制備鑒定以及人a1,6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的初步研究.pdf

1、第一部分的研究?jī)?nèi)容為牛蒡寡糖脂質(zhì)體的制備和鑒定，主要分為牛蒡寡糖含量測(cè)定方法的建立、牛蒡寡糖脂質(zhì)體制備工藝及處方研究以及牛蒡寡糖脂質(zhì)體理化性質(zhì)鑒定三個(gè)方面的內(nèi)容。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模航⒂?jì)算牛蒡寡糖脂質(zhì)體的包封率的方法，優(yōu)化制備牛蒡寡糖脂質(zhì)體的配方，并對(duì)制備好的脂質(zhì)體進(jìn)行理化性質(zhì)和穩(wěn)定性的研究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：建立葡萄糖濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)計(jì)算葡萄糖和牛蒡寡糖之間的換算因子來(lái)達(dá)到對(duì)游離牛蒡寡糖的測(cè)定，從而實(shí)現(xiàn)牛蒡寡糖

2、脂質(zhì)體包封率的計(jì)算；繼而選用藥脂比、有機(jī)相和水相比例以及磷脂和膽固醇比為考察因素，以包封率為主要考察指標(biāo)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化制備處方，并另行考察高壓均質(zhì)條件的優(yōu)化，以此來(lái)優(yōu)化牛蒡寡糖脂質(zhì)體的制備方案；再對(duì)制備好的牛蒡寡糖脂質(zhì)體進(jìn)行理化性質(zhì)和穩(wěn)定性研究，包括形態(tài)的觀察、粒徑的測(cè)定、zeta電勢(shì)的測(cè)定、通過(guò)包封率的測(cè)定研究不同儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性等。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：葡萄糖濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=12.4051x+0.01428(R=0

3、.99962)，線(xiàn)性范圍為0.005-0.15mg/ml。牛蒡寡糖溶液的換算因子f為1.28。通過(guò)截留分子量為30KD的超濾離心管可以對(duì)牛蒡寡糖和脂質(zhì)體進(jìn)行很好的分離。牛蒡寡糖脂質(zhì)體制備最優(yōu)方法為薄膜分散法；制備最優(yōu)條件為：藥脂比1:6，有機(jī)相和水相體積比1:2，卵磷脂和膽固醇質(zhì)量比4:1；高壓均質(zhì)最優(yōu)條件為：壓力800bar，循環(huán)數(shù)3。制備好的牛蒡寡糖脂質(zhì)為粒徑均勻的球狀或近球狀小囊泡，平均粒徑為74.2nm，多相分散系數(shù)為0.582

4、，用微電泳儀測(cè)得其zeta電勢(shì)為-12.56mv，通過(guò)測(cè)定在常溫和4低溫保存下滲透率的變化確定在4下保存具有較好的穩(wěn)定性。但穩(wěn)定性仍有待改善。
　　 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)中成功制備牛蒡寡糖脂質(zhì)體，并對(duì)制備工藝、處方以及理化性質(zhì)和穩(wěn)定性作出了研究，該脂質(zhì)體性質(zhì)比較穩(wěn)定，大小均勻，具有較高的包封率，可進(jìn)行細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)，為其臨床及后續(xù)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分的研究?jī)?nèi)容為可溶性的人α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1，6 Fu

5、cT，F(xiàn)UT8)以及對(duì)抗該酶的多克隆抗體的初步研究。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模哼\(yùn)用三種不同的方法來(lái)表達(dá)可溶性的α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，以用于下游糖蛋白的合成，并為該酶催化和反應(yīng)機(jī)制的研究提供底物支持。制備抗FUT8的多抗，為今后開(kāi)發(fā)癌癥的血清學(xué)診斷試劑打下基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：本論文首先從人胃癌細(xì)胞MKN45細(xì)胞株中擴(kuò)增出FUT8的cDNA，構(gòu)建pET28a-sFUT8載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)進(jìn)行大量表達(dá)。之后對(duì)

6、表達(dá)得到的包涵體蛋白進(jìn)行純化、變性和復(fù)性研究，以純化后的包涵體為免疫抗原四次免疫小鼠，制備多克隆抗體，并測(cè)定其效價(jià)。鑒于原核表達(dá)無(wú)可溶性目的蛋白獲得，實(shí)驗(yàn)中又嘗試了巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)和體外試劑盒表達(dá)α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，實(shí)驗(yàn)將FUT8基因(FUT8)克隆到pPIC9k質(zhì)粒上，電轉(zhuǎn)化入Pichia pastoris GS115菌株，篩選獲得高拷貝的重組菌株，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)FUT8。同時(shí)，我們將構(gòu)建的pET

7、28a-sFUT8載體利用試劑盒在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，利用SDS-PAGE和Western Blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)情況。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)從MKN45細(xì)胞株中成功擴(kuò)增得到FUT8的cDNA，并成功構(gòu)建pET28a-sFUT8原核載體，原核表達(dá)獲得FUT8的包涵體蛋白。我們利用純化后的包涵體進(jìn)行了多抗制備，得到效價(jià)在1:5000至1:10000之間的抗FUT8多抗，為癌癥的血清學(xué)診斷試劑研究打下了基礎(chǔ)。同時(shí)我們成功構(gòu)建pPIC9

8、k-FUT8真核表達(dá)載體，可溶性FUT8蛋白在畢赤酵母中成功表達(dá)。另外，pET28a-sFUT8載體在體外成功表達(dá)，得到了可溶性的FUT8蛋白，SDS-PAGE和Western Blot都驗(yàn)證蛋白成功表達(dá)。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了pET28a-sFUT8原核載體和pPIC9k-FUT8真核載體，并將其分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌和畢赤酵母內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，得到的FUT8目的蛋白。原核表達(dá)得到包涵體蛋白，真核表達(dá)和試劑盒體外表達(dá)都得到少量